Role of collagen chaperone HSP47 on the activation of endoplasmic reticulum stress sensor IRE1α

Abstract

Alteraciones en la homeostasis del retículo endoplasmático (RE) promueven la acumulación de proteínas mal plegadas en su lumen, una condición celular denominada estrés de RE. La adaptación al estrés de RE depende de la activación de la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR: del inglés unfolded protein response). El sensor de estrés de RE, IRE1α, es una proteína transmembrana con actividad kinasa y endoribonucleasa. Bajo condiciones de estrés de RE, IRE1α promueve el procesamiento no convencional del ARNm de Xbp1, generando la expresión del factor de transcripción XBP1s, el cual regula la expresión de genes involucrados en el plegamiento proteico, secreción, control de calidad de proteínas, entre muchas otras funciones. Adicionalmente, bajo condiciones de estrés de RE, IRE1α degrada varios ARNms mediante un proceso conocido como decaimiento de RNA dependiente de IRE1α (RIDD: del inglés regulated IRE1α -dependent RNA decay). En ciertos sistemas bajo estrés de RE prolongado, la activación sostenida de IRE1α puede promover apoptosis en las células dañadas irreversiblemente. Por lo tanto, IRE1α controla la sobrevida celular bajo estrés de RE regulando el equilibrio entre señales adaptativas y pro-apoptóticas. Los mecanismos subyacentes a la activación e inactivación de IRE1α no se conocen completamente, sin embargo, se ha descrito que IRE1α es regulado por la interacción con proteínas que modulan la amplitud de la actividad de IRE1α, a través de una plataforma de señalización conocida como UPRosoma. En nuestro laboratorio se realizaron estudios proteómicos con el objetivo de identificar nuevos componentes del UPRosoma en condiciones de estrés de RE. Mediante inmunoprecipitación de proteínas y espectrometría de masas se identificaron cuatro posibles reguladores de IRE1α que podrían modular su actividad RNasa. Usando esta aproximación experimental, se identificó a HSP47 como un putativo activador y regulador de la vía de señalización IRE1α/XBP1s. HSP47 es una chaperona específica involucrada en el plegamiento de colágeno y se distribuye principalmente en el lumen del RE. En esta tesis, nos propusimos estudiar el posible papel de HSP47 en la regulación de la actividad IRE1α. Específicamente, se evaluó el efecto de HSP47 en la activación de la vía de señalización IRE1α bajo condiciones de estrés ER, evaluando la cinética y amplitud de las respuestas de la vía IRE1α. La caracterización celular y bioquímica utilizando estrategias de pérdida y ganancia de función, reveló que la expresión de HSP47 promueve la señalización de IRE1α. A nivel molecular, Hsp47 se une con alta afinidad al dominio luminal de IRE1α, desplazando al regulador negativo BiP del complejo y facilitando su activación. La regulación de la señalización de IRE1α mediante HSP47 es conservada en la evolución, ya que mediante la manipulación genética, se validaron estos hallazgos en modelos de mosca y ratón. HSP47 opera como un modulador positivo de la señalización de IRE1α, regulando el umbral de activación de la UPR en la sobrevida. En términos generales, los resultados de esta tesis demuestran una nueva función biológica de HSP47 como un componente de la UPR, lo que sugiere que la red de plegamiento en el RE integra la información sobre el estado de plegamiento de las proteínas para establecer un umbral de activación de la vía de IRE1α en la UPR. Considerando la complejidad de la vía IRE1α/XBP1s/RIDD en la sobrevida celular, es fundamental identificar los mecanismos moleculares implicados en la regulación de esta vía en condiciones de estrés RE.

Alterations in the endoplasmic reticulum (ER) homeostasis results in the accumulation of misfolded/unfolded proteins in its lumen, a cellular condition referred to as ER stress. Adaptation to ER stress depends on the activation of the unfolded protein response (UPR). The ER stress sensor and UPR transducer inositol-requiring enzyme 1α (IRE1α) is a bifunctional kinase and endoribonuclease enzyme that upon activation catalyzes the unconventional splicing of the mRNA encoding the transcription factor X-box-binding protein 1 (XBP1). XBP1 spliced (XBP1s) mediates the upregulation of crucial UPR-related genes involved in folding, secretion and protein quality control, among other functions. In addition, under ER stress conditions, IRE1α degrades a subset of mRNAs through a process known as regulated IRE1α-dependent RNA decay (RIDD). Under prolonged ER stress, sustained activation of IRE1α, sensitizing irreversible damaged cells to undergo apoptosis. Therefore IRE1α controls cell fate under ER stress triggering adaptive and pro-apoptotic signals. The mechanisms underlying IRE1α activation/inactivation are not fully understood, but it has been described that IRE1α is regulated by several proteins that interact and modulate the amplitude of IRE1α´s activity through a signaling platform known as the UPRosome. Proteomic studies were conducted in our lab in order to identify new components of the UPRosome coupled to IRE1α in ER stress conditions. Co-immunoprecipitation followed by mass spectrometry analysis was performed and four putative IRE1α regulators that could modulate the amplitude and kinetics of IRE1α RNAse activity on XBP1 were discovered. Through this analysis, we identified heat shock protein 47 (HSP47) as a putative activator of IRE1α/XBP1s signaling pathway. HSP47 is a specific chaperone involved in collagen folding located in the ER lumen. In this thesis, we proposed to study the possible role of HSP47 in the regulation of IRE1α activity. Specifically, we studied the role of HSP47 on the activation of the IRE1α signaling pathway under ER stress. Cellular and biochemical characterization, using gain and lose-function strategies, revealed that Hsp47 expression instigates IRE1α signaling. At the molecular level, Hsp47 directly binds with high affinity to the ER luminal domain of IRE1α, displacing the negative regulator BiP from the complex to facilitate its activation. The regulation of IRE1α signaling by Hsp47 is conserved in evolution, as validated using genetic manipulation in fly and mouse models. We conclude that Hsp47 operates as an adjustor IRE1α signaling, fine-tuning the threshold to engage an adaptive UPR. Overall, our results have uncovered a novel biological function of HSP47 as an adjustor of the UPR, suggesting that the ER folding network integrates information about the protein folding status at the ER to set the threshold for IRE1α activation. Considering the participation of the IRE1α axis on cell fate, it is crucial to identify the molecular mechanisms involved in the regulation of this pathway under ER stress conditions.