Péptidos derivados del receptor de melanocortina 1 (MC1R) son eficientemente reconocidos por linfocitos T citotóxicos en pacientes con melanoma

Abstract

Antecedentes: El melanoma es un tumor maligno derivado de los melanocitos que tiene mal pronóstico cuando se detecta en etapas avanzadas de la enfermedad. Las terapias habituales como la radio y quimioterapia no logran resultados satisfactorios en la mayoría de los pacientes en etapas avanzadas. La inmunoterapia ha surgido en los últimos años como una promisoria estrategia para frenar el crecimiento e incluso erradicar tumores metastásicos. Mientras mejor se comprenda la biología tumoral, se pueden perfeccionar cada vez más las actuales técnicas de inmunoterapia. Es por ello que la identificación de antígenos asociados a tumores resulta ser inmensamente trascendente. El receptor de melanocortina 1 (MC1R) es el ligando natural de la hormona estimulante de los melanocitos (MSH) y de la adrenocorticotropina (ACTH). Es un receptor acoplado a proteína G implicado en la pigmentación, crecimiento celular, homeostasis, inflamación, esteroidogénesis y control de la temperatura. Se expresa principalmente en melanocitos, y en menor grado en la glándula suprarrenal, pero también se encuentra presente en la mayoría de las biopsias de melanoma y líneas celulares derivadas de melanoma, lo que lo transforma en un candidato atractivo como antígeno tumoral. Previamente en nuestro laboratorio demostramos que tres péptidos hidrófobicos derivados de MC1R y de afinidad intermedia por la molécula MHC case 1 HLA-A2 (MC1R291-298, MC1R244-252 y MC1R283-291) pueden inducir una respuesta específica de linfocitos T citotóxicos (CTL) a partir de linfocitos de sangre periférica de donantes normales (PBL). Por otra parte, estos CTL específicos para péptidos derivados de MC1R reconocen un panel de melanomas HLA-A2+, lo que demuestra que en humanos, algunas líneas celulares de melanoma presentan naturalmente epítopos de MC1R. Sin embargo, la presencia natural de células T específicas para MC1R en linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) y en sangre de pacientes con melanoma sigue siendo desconocida, así como también no se ha estudiado el efecto que tiene el aumentar la afinidad de los péptidos derivados de MC1R por el complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) en cuanto a la generación de una respuesta in vitro específica, es decir, para probar si este aumento de la afinidad facilita la generación de linfocitos específicos que puedan reconocer también el péptido nativo que es expresado naturalmente por melanomas. Métodos: Se evaluó la presencia de linfocitos TCD8+ específicos anti-MC1R en una población de linfocitos T derivados de PBL y de TIL de pacientes con melanoma HLA-A2+. Luego se crearon péptidos modificados derivados del péptido MC1R291-298 (MC1R291) con afinidad aumentada por la molécula MHC clase I, y se utilizaron para inducir linfocitos de donantes normales a partir de PBL, Resultados: Se indujeron linfocitos específicos para los tres péptidos nativos derivados de MC1R que fueron capaces de lisar melanomas alogénicos HLA-A2+ MC1R+, a partir de PBL de pacientes, lo que demuestra la existencia de un repertorio de células T anti-MC1R en pacientes con melanoma. Por otra parte, los TILs también evidencian actividad anti-MC1R y contra líneas celulares de melanoma. Además, se aislaron clones de linfocitos T CD8+ específicos para el péptido MC1R244-252 (MC1R244) de células derivadas de TIL y se identificó un subconjunto de células específicas para MC1R291 utilizando tetrámeros. Al utilizar los péptidos modificados de MC1R291, obtuvimos que para algunos donantes funciona mejor utilizar alguno de los péptidos modificados que el péptido nativo de MC1R, mientras que en otros donantes funciona mejor el péptido nativo. Conclusión: En este trabajo se demuestra que los péptidos derivados de MC1R son epítopos inmunogénicos que naturalmente son reconocidos por TILs específicos para melanoma y que son capaces de inducir CTL in vitro, por lo tanto pueden ser útiles para el desarrollo de nuevas técnicas de inmunoterapia anti-melanoma. Asimismo el aumento de la afinidad de un péptido por la molécula MHC-I no siempre se traduce en un aumento sustancial de la capacidad inmunogénica de dicho péptido. El efecto de aumentar la afinidad del péptido nativo de MC1R291, no logra un efecto constante ni funciona igual para todos los donantes. Sin embargo, observamos que al menos alguno de los péptidos modificados funciona para la mayoría de los donantes estudiados, y demostramos que se puede inducir actividad anti-MC1R utilizando péptidos modificados, en donantes en los que en una primera instancia el péptido nativo no funcionó, lo cual mejora sustancialmente el rendimiento en cuanto a la generación de linfocitos específicos para un péptido.

BACKGROUND: Melanoma is a malignant tumor derived from melanocytes that has a poor prognosis when is detected at advanced stages of the disease. The usual therapies such as radiotherapy and chemotherapy fail to obtain satisfactory results in the majority of patients in advanced stages. Immunotherapy has emerged in recent years as a promising strategy to slow the growth or even eradicate metastatic tumors. The better understanding of the tumor biology, can increasingly improve current techniques of immunotherapy. This is why the identification of tumor-associated antigens seems to be immensely important . Melanocortin receptor 1 (MC1R) is the natural ligand of the melanocyte stimulating hormone (MSH) and ACTH. It is a G-protein coupled receptor involved in pigmentation cell growth, homeostasis, inflammation, steroidogenesis and temperature control. Is expressed primarily in melanocytes, and to a lesser extent in the adrenal gland but is also present in most melanoma biopsies and cell lines derived from melanoma, which transforms MC1R into an attractive candidate as a tumor antigen. We previously demonstrated that three hydrophobic low and intermediate-affinity HLA-A2- restricted MC1R derived peptides: MC1R291-298, MC1R244-252 and MC1R283-291, can induce specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) lymphocytes from peripheral blood of normal donors (PBL). Moreover, these MC1R specific CTL recognize a panel of HLA- A2+ melanomas, demonstrating that in humans, melanoma cell lines naturally present MC1R epitopes. However, the natural presence of MC1R-specific T cells in melanoma patient's tumour and blood remains unknown. As well, the effect of increasing the affinity of MC1R derived peptides for the major histocompatibility complex class I (MHC-I), has not been studied in concerning to the generation of a specific in vitro response, that is, to test whether this increased affinity facilitates the generation of specific lymphocytes that can also recognize the native peptide which is naturally expressed in melanomas. METHODS: The presence of anti-MC1R specific CD8+ T cells was established in a population of melanoma-specific T cells derived PBL and tumour-infiltrating lymphocytes (TIL) from HLA-A2+ melanoma patients. Then, we synthesize modified MC1R291-298 (MC1R291) derived peptides with increasing affinity for the MHC-I molecule, and were used to induce lymphocytes from normal donor PBL. RESULTS: CTLs specific for the three MC1R-derived peptides that lysed allogeneic HLA-A2+MC1R+ melanomas were elicited from PBMC, demonstrating the existence of an anti-MC1R T cell repertoire in melanoma patients. Moreover, TILs also recognized MC1R epitopes and HLA-A2+ melanoma cell lines. Finally, HLA-A2/MC1R244-specific CD8+ T cell clones derived from TILs and a subset of MC1R291 specific T cells were identified using HLA-A2/MC1R tetramers. By using the modified MC1R291 derived peptides, we note that for some donors the modified peptides work better than the native MC1R peptide, while in other donors the native peptide works better. CONCLUSION: Our results demonstrate that MC1R-derived peptides are common immunogenic epitopes for melanoma-specific CTLs and TILs, and may thus be useful for the development of anti- melanoma immunotherapy. The increase in the affinity of a peptide for the MHC molecule does not result always in a substantial immunogenicity increase of this peptide. The effect of increasing the affinity of the native MC1R291 peptide does not achieve a constant effect and works the same for all donors. However, we note that at least one of the peptides works for almost all donors studied, and we show that anti-MC1R activity can be induced using modified peptides in donors in which in the first instance the native peptide did not work, which substantially improves performance in the generation of lymphocytes specific for a peptide.