Caracterización de los perfiles de proteínas de membrana externa (PMEs) de cepas de Escherichia coli adherente invasivas (ACAISs) obtenidas desde pacientes con enfermedades de Crohn

Abstract

E. coli adherente invasiva (ECAI) es un patotipo que se ha asociado fuertemente con la etiopatogenia de la Enfermedad de Crohn (EC), pero su rol no está bien definido. Los principales mecanismos de patogenicidad descritos para ECAI son: i) capacidad de adherirse a células epiteliales, ii) invadir células epiteliales, y iii) sobrevivir en el interior de macrófagos. Sin embargo, se han descrito pocas proteínas que participen directamente en tales procesos, y la mayoría se ha evaluado sólo en la cepa ECAI LF82. En este contexto es importante el estudio de proteínas de membrana externa (PMEs), ya que al estar involucradas en la interacción bacteria-hospedero, pueden aportar al entendimiento de las propiedades de ECAI. El objetivo de este trabajo fue identificar PMEs características de ECAIs, ausentes en la cepa comensal de referencia E.coli HS y cuyos genes no fuesen detectables en otras cepas comensales de E. coli. Para ello se caracterizaron como ECAIs aislados de E. coli provenientes de pacientes con EC, evaluando su capacidad de adherirse e invadir células Caco-2 y sobrevivir en macrófagos RAW 264.7. Luego, se analizaron mediante 2D-PAGEs los extractos de PMEs de estas cepas y se creó un gel virtual que reuniera >70% de los spots presentes en las cepas analizadas. Este gel se comparó con el de la cepa comensal E. coli HS, enviando a identificar mediante MALDI-TOF/TOF aquellos spots característicos de ECAIs y ausentes en la cepa E. coli HS. Además, mediante BLASTp y PCR se determinó la presencia de los genes que codifican dichas proteínas en otras cepas ECAIs y comensales. Se identificaron 4 PMEs características de ECAIs (71-100%) y poco frecuentes en E. coli comensales (13%): ChuA, OmpT, FitA y EefC/NodT. También se encontró en los extractos de PMEs de las cepas ECAI a la proteína citoplasmática EF-Tu, la cual se ha asociado con mecanismos de adhesión de otros patógenos. Se proyecta realizar estudios relacionados con la función de estas PMEs y su rol en mecanismos de patogenicidad del patotipo ECAI.

Invasive adherent E. coli (AIEC) is a pathotype strongly associated with the pathogenesis of Crohn’s Disease (CD), albeit whit a yet unclear role. The main pathogenic mechanisms described for AIEC are: i) adherence to epithelial cells; ii) invasion of epithelial cells, and iii) survival in macrophages. Few proteins have been described to participate directly in these processes, most of which have been evaluated only in the AIEC LF82 reference strain. Studying outer membrane proteins (OMPs) is important because they participate in host-bacteria interactions and increasing knowledge on their role in pathogenic and adaptation mechanism may help to better understand the properties of AIEC. The objective of this study was to identify OMPs characteristic of AIEC, absent in the E. coli HS reference strain, with genes undetectable in other commensal E. coli strains. We characterized AIEC strains isolated from patients with CD and determined their capacity to adhere and invade Caco-2 cells and survive in RAW 264.7 macrophages. We then analyzed OMPs extract from these strains by 2D-PAGE and created a virtual gel including >70% of the spots generated by AIEC strains. This gel was compared to gel containing spots of the E. coli HS commensal strain, further analyzing by MALDI-TOF/TOF spots present in AIEC and absent in E. coli HS. In addition, we determined the presence of the genes encoding for these proteins in other AIECs and commensal strains using BLASTp and PCR. We identified 4 OMPs common in AIEC strains (71-100%) and infrequent in commensal strains (13%): ChuA, OmpT, FitA and EefC/NodT. In addition, we found the cytoplasmic protein EF-Tu in OMPs extract from AIECs, which has been associated with adherence mechanism of other pathogens. Future studies are planned to determine the specific function of these OMP and their role in pathogenicity of AIEC.