RUNX2 promueve la angiogénesis y la expresión de genes blanco con función pro-angiogénica en osteosarcoma

Abstract

Runx2 es un factor transcripcional, regulador maestro del desarrollo y de la diferenciación osteoblástica. Regula positiva o negativamente la expresión de diversos genes que participan en la proliferación de precursores pre-osteoblásticos y osteoblásticos, y en la diferenciación de estos. Además, este factor tiene un rol funcional en la progresión tumoral y metástasis asociadas al cáncer de próstata y de mama. Recientemente, la expresión de Runx2 se ha relacionado con el desarrollo de osteosarcoma, tumor óseo altamente agresivo y de mal pronóstico, que actualmente es objetivo de tratamientos como quimioterapia y cirugías que pueden llegar a la amputación de extremidades. Existe una correlación positiva entre la expresión del factor transcripcional Runx2 y la incidencia de metástasis pulmonares en osteosarcoma. Por otra parte, en distintos tipos tumorales se ha descrito la expresión de genes como; MMPs, VEGF y osteopontina (OPN), asociados a la angiogénesis y progresión tumoral. Interesantemente, la expresión de estos genes es regulada directamente por Runx2 y se expresan normalmente durante la diferenciación osteoblástica en el tejido óseo. Así, existen evidencias que demuestran los efectos angiogénicos de la expresión de VEGF y OPN, tanto en patología no tumoral como tumoral. La angiogénesis es un mecanismo fundamental en cáncer, favoreciendo la progresión y metástasis, y por lo tanto clave en patología tumoral maligna. En el caso del osteosarcoma, un fenotipo agresivo y de mal pronóstico se asocia con mayor neo-vascularización. En esta tesis, se propone que Runx2 promueve la angiogénesis en osteosarcoma y regula la expresión de genes relacionados a este proceso. Lo anterior fue llevado a cabo mediante el uso de distintas líneas celulares de osteosarcoma humano. Se analizó la expresión de Runx2 siendo mayor en la línea celular SaOS y mínima en MG63. Las líneas celulares U2OS, HOS y G292 presentaron expresión variable entre SaOS y MG63. En relación a la capacidad angiogénica in-vitro esta fue similar a lo anterior, presentando SaOS los mayores niveles y MG63 los menores, y el resto variable entre ambas líneas. La búsqueda de genes relacionados al proceso de angiogénesis se realizó a partir del análisis de los datos generados en experimentos de knock in de Runx2 mediante siRNA y análisis del transcriptoma mediante microarray, en la línea celular SaOS, en combinación con el análisis de una base de datos de ChIP on CHIP para Runx2, en la misma línea celular. Los genes fueron analizados mediante el software DAVID 6.7 (Functional Annotation Bioinformatics Microarray data base), seleccionando a los con función angiogénica y que además codifican para proteínas de secreción. Así se obtuvo un total de 4 genes angiogénicos: Endotelina 1 (END1), Angiogenina (ANG), Colágeno tipo V alfa 1 (COL5A1) e Inductor angiogénico rico en cisteína 61 (CYR61). La regulación, mediada por Runx2, de genes blanco angiogénicos se estudió mediante la modulación de la expresión de Runx2 en distintas líneas celulares de osteosarcoma, mediante la utilización de vectores adenovirales y siRNA o shRNA y en combinación con ensayos de angiogénesis in vitro. Así mediante RT-qPCR se observó que los genes CYR61 y VEGFA aumentaron su expresión en las líneas MG63, U2OS, HOS y G292. Por el contrario al inhibir Runx2 en SaOS, se obtuvo una baja de los niveles de CYR61 y VEGFA. Lo mismo se observó al analizar los niveles de proteína de CYR61 mediante western blot. Por último el rol funcional de Runx2 sobre el proceso angiogénico se analizó mediante la sobre-expresión de Runx2, observándose un aumento de la capacidad angiogénica de la línea MG63, por el contrario al inhibir Runx2 en SaOS se observó una disminución de la capacidad de angiogénesis por parte de esta línea celular. Es así como hemos demostrado por primera vez que Runx2 promueve la angiogénesis y CYR61 en osteosarcoma humano.

Runx2 is a transcriptional factor, master regulator of osteoblast differentiation and development. Positively or negatively regulate expression of various genes involved in the proliferation of pre-osteoblast and osteoblast precursors, and in the differentiation of these. Moreover, this factor has a functional role in tumor progression and metastases associated with prostate and breast cancer. Recently, Runx2 expression has been linked to the development of osteosarcoma, bone highly aggressive tumor with poor prognosis, which currently is target of treatments such as chemotherapy and surgeries that can reach limb amputation. There is a positive correlation between the expression of the transcription factor Runx2 and the incidence of lung metastases in osteosarcoma. Apart, in different types of tumor described as gene expression, MMPs, VEGF and osteopontin (OPN), associated with angiogenesis and tumor progression. Interestingly, the expression of these genes is regulated directly by Runx2 and are normally expressed during osteoblast differentiation in the bone tissue. Thus there is evidence that shows the angiogenic effect of VEGF and OPN expression in both non tumor as in tumor pathology. Angiogenesis is a fundamental mechanism in cancer progression and metastasis promoting, and therefore key in malignant tumors. In the case of osteosarcoma, an aggressive phenotype and poor prognosis is associated with increased neovascularization. In this thesis, we propose that Runx2 promotes angiogenesis in osteosarcoma and regulates the expression of genes related to this process. This was carried out by using various human osteosarcoma cell lines. Runx2 expression was higher in SaOS cell line and lowest in MG63 cell line. The U2OS, HOS and G292 cell lines exhibited variable expression of Runx2 protein, between MG63 and SaOS. In relation to in-vitro angiogenic capacity, this was similar to the above, presenting SaOS the highest levels and MG63 the lowest. The rest was variable between the two lines. The search for genes related to the angiogenic process was performed through the analysis of the data generated in experiments of knock-in of Runx2 using siRNA and microarray transcriptome analysis, in the SaOS cell line, in combination with the analysis of a base ChIP on CHIP data for Runx2 in the same cell line. Genes were analyzed using DAVID 6.7 software (Functional Annotation Bioinformatics Microarray database), selecting those with angiogenic function and also encode secreted proteins. Endothelin 1 (END1), Angiogenin (ANG), type V collagen α 1 (COL5A1) and cysteine-rich angiogenic inducer 61 (CYR61) were obtained. Runx2 mediated regulation of angiogenics target genes was studied by modulating Runx2 expression in different cell lines of osteosarcoma, using adenoviral vectors for overexpressing Runx2 and siRNA or shRNA to inhibit its expression. So by RT-qPCR was observed that CYR61 and VEGFA genes were increased in all the cell lines over-expressing Runx2. Conversely inhibiting Runx2 in SaOS, decreased levels of CYR61 and VEGFA. The same was observed when analyzing the CYR61 protein levels by Western blot. Finally the functional role of Runx2 on the angiogenic process was analyzed by the over-expression of Runx2 in MG63 cell line. An increase in the angiogenic capacity was observed, conversely inhibiting Runx2 in SaOS decrease the angiogenic capacity. Thus we have shown for the first time that Runx2 promotes angiogenesis and CYR61 in human osteosarcoma.