Mecanismo de inmunidad, de translocación y de conversión tipo prion de la microcina E492.

Abstract

La microcina E492 (MccE492) es un polipéptido antibiótico que presenta actividad bactericida sobre cepas de la familia Enterobactereaceae mediante la formación de canales iónicos en la membrana citoplasmática. Los determinantes genéticos necesarios para su producción, presentes en el genoma de Klebsiella pneumoniae RCY492, se clonaron y expresaron en Escherichia coli, obteniéndose una microcina recombinante con propiedades bioquímicas y biológicas idénticas a la producida por Klebsiella. Mediante mutagénesis con Tn5 se determinó la existencia de al menos 8 genes, además del gen estructural, involucrados en procesos de maduración, procesamiento y exportación de la microcina. La MccE492 es secretada en forma activa (Mcca ) durante la fase exponencial de crecimiento, e inactiva (Mccia) durante la fase estacionaria, fenómeno asociado a la falta de expresión de los genes mceI y J durante esta última fase. Mutantes por transposición en los genes mceC, I y J sólo producen Mccia en forma independiente de la fase de crecimiento, indicando que la producción de Mccia es causada por la falta de un proceso de maduración a cargo de los productos de estos genes. Este proceso de maduración no implica modificaciones postraduccionales de la MccE492, ya que ambas formas de la microcina presentan la misma masa molecular, con un valor que es idéntico al valor esperado a partir de la secuencia del gen estructural. Se determinó que la diferencia funcional entre ambas formas de la microcina no se debe a diferencias en su estructura primaria, sino a diferencias en el contenido de estructura secundaria. La Mccia presenta una mezcla de hélice- tanto que Mcca presenta un alto contenido de hoja-. La Mccia mantiene la capacidad para formar canales iónicos en la membrana citoplasmática, lo cual fue demostrado en experimentos in vitro con bicapas fosfolipídicas e in vivo mediante esferoplastos, los cuales son sensibles a la Mccia. Estos experimentos además demuestran que la Mccia es incapaz de atravesar la membrana externa de la célula blanco. Por otro lado, ensayos de competencia entre ambas formas de la microcina muestran que la actividad de Mcca no es inhibida por Mccia en concentraciones saturantes (100 veces mayor). Este resultado sugiere que Mccia falla en el reconocimiento de un receptor, ya que si ésta quedara “atrapada” durante la translocación hacia el periplasma, bloquearía la vía de entrada de Mcca e inhibiría su actividad bactericida. Por lo tanto, el proceso de maduración le confiere a la MccE492 la conformación/oligomerización correcta para que pueda reconocer/interaccionar con un receptor en la membrana externa de la célula blanco. La existencia de dos formas funcionales de la MccE492 con idéntica estructura primaria pero con diferente conformación, asemejan a la MccE492 con el fenómeno que se ha descrito para priones. Un prión se define como una proteína con características infecciosas, que puede inducir un cambio desde una estructura normal a una infecciosa. Al igual como sucede en priones, la Mcca (mayor contenido de estructura hoja-) posee la capacidad de convertir a la forma inactiva hacia la forma activa, como se demostró en ensayos de activación diseñados para tal efecto, en los cuales se observó una ganancia en la actividad que va desde 2 a 27 veces. Esta ganancia de actividad fue acompañada por un incremento en el contenido de conformación hoja-, determinado mediante dicroismo circular en el UV-lejano. Estas conversiones se alcanzaron utilizando muestras de microcina altamente puras, y el fenómeno de activación fue propagado a través de ciclos de activación. Este resultado sugiere fuertemente que la información conformacional se transmite de proteína a proteína siendo menos probable la necesidad de algún otro factor. Un segmento de la MccE492 (residuos 16-38) presenta homología con la región conservada PrP (106-126) de los priones de mamíferos, responsable de la conversión conformacional. En ensayos de conversión in vivo, la cepa mutante np220 productora de MccE492(1- 43), fue capaz de activar a Mccia lo que se observó como un halo de inhibición de crecimiento cuando ambas cepas son sembradas juntas sobre un césped de células sensibles, fenómeno que no se observa cuando ambas cepas son sembradas por separado. Estos resultados sugieren fuertemente que ésta región es la que le confiere el comportamiento priónico a la microcina E492. La proteína integral de membrana MceB confiere inmunidad a la MccE492, en un mecanismo altamente eficiente y específico. El mecanismo más probable para su acción incluye una interacción con TonB, proteína esencial en la acción de la microcina. TonB sería necesaria para la inserción de la microcina en la membrana citoplasmática, ya que esferoplastos TonB no presentan sensibilidad a Mcca ni a Mccia. Se utilizó una aproximación genética de compensación de mutantes puntuales, para estudiar la existencia de una interacción entre MceB y TonB. Mediante mutagénesis química del gen mceB se aislaron las mutantes puntuales MceBA17V y MceBA77V asociadas con una pérdida de la inmunidad, cambios ubicados en la primera y tercera hélice de transmembrana respectivamente, de acuerdo al modelo topológico de MceB. Este modelo es apoyado por fusiones obtenidas entre MceB y la proteína PhoA, ya que sólo las fusiones que ocurrieron en la vuelta periplasmática de MceB presentaron actividad PhoA, contrario a lo observado en fusiones en hélices de transmembrana. Los cambios obtenidos en MceB son conservados y afectarían la interacción específica de MceB con TonB a través de sus hélices de transmembrana, como consecuencia de un cambio en el empacamiento de la hélice, hecho que se ha demostrado disminuye la constante de unión entre hélices de transmembrana. Esto se demostró en experimentos de mutagénesis en los que se encontró mutantes de TonB con la capacidad de compensar el fenotipo imm de mutantes en MceB. Estas correspondieron a 3 tipos: las mutantes truncas TonB43-239 y TonB109-239, y la mutante puntual TonBS16L localizada en la hélice de transmembrana de la proteína, mutantes de TonB que no cumplen su función biológica normal. TonB se encuentra en permanente transición entre isómeros energéticos, propiedad que depende de su interacción con receptores de membrana externa a través del extremo carboxilo terminal y con la proteína ExbB a través de la hélice de transmembrana. Las mutantes de TonB pierden esta capacidad, lo que aumentaría la disponibilidad de TonB para interaccionar con MceB. De este modo se compensa la disminución en la afinidad entre ambas proteínas que provocan las mutaciones puntuales en MceB. No obstante, las células que portan las mutantes truncas de TonB presentaron sensibilidad a la MccE492. Estos resultados nos permiten concluir que sólo la región N-terminal de TonB interactúa con MceB y, además, que sólo ésta región es necesaria para a la acción de MccE492. Por lo tanto, la proteína TonB estaría implicada en la inserción de la MccE492 en la membrana interna, y no en la translocación de través de la membrana externa, a través del dominio periplasmático, como se ha descrito para otros procesos TonB-dependientes, incluida la acción de colicinas formadoras de poros. Lo anterior es apoyado por la resistencia a la microcina que presentan los esferoplastos TonB y mediante ensayos con el pentapéptido sintético caja-TonB, el cual no posee un efecto inhibitorio sobre la actividad de la MccE492, como se ha descrito para la importación de moléculas que requieren de la proteína TonB para su translocación a través de la membrana externa.

Microcin E492 (MccE492) is an antibiotic polypeptide active on strains of the family Enterobacteraceae. Its mechanism of action is through ion channels formation into the inner membrane of the target cell. The genetic determinants necessary for the production of active microcin are located in the chromosome of Klebsiella pneumoniae RCY492. These were cloned and expressed in E. coli and the recombinant microcin obtained had identical biochemical and biological properties compared with the native microcin. The existence of eight accessory genes necessary for the production of active microcin was determined through random Tn5 mutagenesis. These genes are involved in maturation, processing and export of microcin E492. MccE92 is secreted in an active (Mcca ) and inactive (Mccia) form in the exponential and stationary phase of growth, respectively. This phenomenon correlated with the lack of transcription of mceI and J genes in the stationary phase. Mutations in mceC, I and J genes result in the production of Mccia at any growth phase, indicating that the production of Mccia is caused by the lack of a maturation process. This process does not imply posttranslational modifications of MccE492 because both forms, active and inactive, present the same molecular mass, with a value that is identical to the expected value deduced from the gen sequence. The functional difference between both microcin forms is not due to a difference in the primary structure, but to a difference in secondary structure. Mccia presents a high content of -helix structure, while Mcca has a high content of - sheet structure. Mccia is able to form ion channels in phospholipidic bilayers, although with differences in conductance when compared with Mcca . On the other hand, Mccia has a lethal effect when incubated with spheroplasts of sensitive cells, indicating that the inactive microcin is not able to cross the outer membrane of the target cell. In addition, the activity of Mcca is not inhibited by high concentrations of Mccia (100-fold over Mcca concentration), indicating that the defect of Mccia is at the level of receptor recognition, because a defect in the translocation process should result in a blockade of the entryway of Mcca , reducing its lethal effect. Therefore, it is possible to conclude that the maturation process confers MccE492 the correct conformation/oligomerization necessary in the recognition/interaction with the receptor in the outer membrane of the target cell. The existence of two functional forms of MccE492 with identical primary structures but with differences in their conformation resembles the phenomenon that has been described for prions. A prion is a protein with infectious properties that induces a change from a normal protein to an infectious one. As happens in prions, Mcca (high -sheet content) possesses the ability to convert the inactive form into the active form, as was shown in activation assays performed in different solvents, in which an increase of activity of 2 - 27 fold was observed. This increase in the activity was accompanied by an increase in the -sheet conformation, determined by far-UV circular dichroism. These conversions were performed with highly purified microcin samples and the activation phenomenon was propagated in cycles of activation. These results strongly suggest that the conformational information is propagated from protein to protein and the need of another factor is less probable. A segment of the MccE492 (residues 16-38) is homologous to the conserved region PrP (106-126) of mammalian prions, a region responsible for the conformational conversion process. A growth inhibition halo was observed when the mutants np220 (MccE492(1-43)) an inactive truncated microcin) and np133 (Mccia, a maturation mutant in mceC) were seeded together onto a sensitive cell lawn. This phenomenon was not observed when both strains were seeded separately, indicating that Mccia was activated by MccE492(1-43). These results strongly suggest that this region confers the prion-like properties to MccE492. The integral membrane protein MceB confers immunity to MccE492, in a specific and highly efficient mechanism. The most probable mechanism includes an interaction with TonB, a protein that is essential for the microcin action. TonB is necessary for the insertion of microcin into the cytoplasmic membrane, because TonB spheroplasts are not sensitive to Mcca or to Mccia. To study the existence of an interaction between MceB and TonB, genetic experiments involving compensation of point mutations were performed. After chemical mutagenesis of the mceB gene, the point mutations MceBA17V and MceBA77V associated with the loss of immunity were isolated. Both mutants presented conserved changes, which are located in transmembrane helices according to a topological model of MceB. Fusions obtained between MceB and PhoA protein were consistent whit this model, because fusions that occurred in the periplasmic loop of MceB presented PhoA activity, in contrast whit the lack of activity found in the fusions that occurred in transmembrane-helices. The point mutations in MceB would modify the helix packing value, an important parameter in the interaction between transmembrane helices. In this way, point mutations in MceB would diminish the binding constant between this protein and TonB through their transmembrane segments. This was confirmed by compensatory mutations in TonB. Three kinds of TonB mutants with the ability to compensate the imm phenotype of the MceB point mutants were isolated: truncated TonB43-239 and TonB109-239 mutants, and the TonBS16 point mutant. These mutants do not carry out the normal biological function of TonB. This protein is in a permanent transition between energetic isomers, property that depends on its interaction with the outer membrane receptors through the C-terminal region and with the ExbB protein through the transmembrane helix. The lack of isomerization process of TonB mutants would increase its availability to interact with MceB and in this way would compensate the decrease in the affinity between both proteins due to the point mutations in MceB. Truncated TonB proteins are sensitive to MccE492 action, indicating that only the N-terminal region of TonB is necessary for microcin action, probably for the insertion of MccE492 into the cytoplasmic membrane. TonB would not be involved in the translocation of microcin across the outer membrane, as it has been described for other TonB dependent processes such as the action of pore-forming colicins, because the TonB mutants lack the C-terminal domain responsible for the interaction with the receptors. This is further confirmed by the lack of inhibition of microcin activity by the pentapeptide corresponding to a synthetic TonB-box. In similar conditions, this peptide produces the inhibition of the import of molecules that requires the TonB protein for them translocation across the outer membrane.