Identificación y caracterización de genes para la síntesis de metabolitos especializados y bacteriocinas de Pseudomonas sp. I1 involucrados en la capacidad de inhibir el crecimiento de patógenos microbianos

Abstract

La resistencia a los antimicrobianos está generando un problema de salud pública a nivel mundial. Se estima que para el año 2050 no se contará con antimicrobianos efectivos para combatir las enfermedades causadas por bacterias multirresistentes especialmente en pacientes inmunocomprometidos, lo que aumentaría drásticamente la tasa de morbilidad y mortalidad. La mayor parte de los antimicrobianos utilizados en medicina son inicialmente producidos por microorganismos. Por lo tanto, investigar metabolitos especializados de bacterias con funciones antimicrobianas puede dirigir a encontrar nuevos antibióticos. En nuestro grupo de investigación, se aislaron dos bacterias del Río Mapocho en Santiago de Chile con potencial para la producción de compuestos antimicrobianos, evidenciado por la inhibición del crecimiento de diversos patógenos bacterianos humanos. Mediante secuenciación genómica estos aislados se identificaron como Pseudomonas sp. I1 y Desemzia incerta I2. Sin embargo, se desconocen los mecanismos de inhibición de dichos aislados. En este trabajo se investigaron los probables determinantes de inhibición en el genoma de Pseudomonas sp. I1. Con base en su potencial inhibitorio, se postula que esta bacteria posee genes que codifican bacteriocinas y/o proteínas responsables de la síntesis de metabolitos especializados asociados a la inhibición del crecimiento de patógenos microbianos. Para corroborar dicha hipótesis, se planteó aplicar técnicas de minería genómica con el objetivo de identificar y caracterizar genes para la síntesis de metabolitos especializados y bacteriocinas de Pseudomonas sp. I1 probablemente involucrados en la capacidad de inhibir el crecimiento de patógenos microbianos. En primer lugar, se identificaron clusters de genes que codifican para la síntesis de metabolitos especializados y bacteriocinas hipotéticos en el genoma de Pseudomonas sp. I1, empleando los programas de minería genómica antiSMASH y BAGEL4. El programa antiSMASH reveló la presencia de cinco clusters con vías tipo NRPS (sintetasas de péptidos no ribosomales) para la producción de lokisina, nunamicina, cichopeptina y pioverdina (2 clusters), además de una vía hipotética para la producción de una betalactona. El análisis utilizando BAGEL4 permitió identificar la presencia de tres clusters que codifican bacteriocinas, correspondientes a piocinas tipo S. Posteriormente, se determinó que tres de los clusters de vías NRPS identificados por antiSMASH, lokisina, nunamicina y cichopeptina, no son independientes, sino que corresponden a fragmentos de un mismo cluster, cuyos productos están involucrados en la biosíntesis de lokisina y que fueron localizados en diferentes contigs. El análisis de los dos clusters que codifican hipotéticamente para pioverdina determinó que éstos codifican enzimas que forman parte de una misma vía y poseen los genes cuyos productos son esenciales para la biosíntesis de pioverdina. El cluster para betalactona hipotética posee muy baja identidad de genes con la vía más parecida en la base de datos y posiblemente produciría un nuevo tipo de betalactona. Respecto a las bacteriocinas hipotéticas, en dos de ellas no fue posible identificar todos los dominios típicos de las piocinas S, mientras que la tercera bacteriocina presenta una combinación de dominios nueva, ausente en las piocinas caracterizadas hasta el momento, y se denominó piocina S14. El análisis mediante BLASTP identificó 20 homólogos de la piocina S14, conservados en diferentes especies de Pseudomonas. Se determinó que la piocina S14 posee un dominio carboxilo-terminal que no conserva motivos nucleasas ya descritos, por lo tanto, pertenecería a una nueva familia de DNasas. Una búsqueda del dominio carboxilo-terminal de la piocina S14 identificó 953 proteínas en diversas especies bacterianas de γ-proteobacterias que poseen este dominio. Un alineamiento múltiple de estas secuencias identificó 13 aminoácidos conservados que podrían ser esenciales para la función de esta nueva familia de DNasas. En conclusión, se determinó que el genoma de Pseudomonas sp. I1 posee genes cuyos productos estarían asociados a la síntesis de moléculas con potencial inhibitorio, como péptidos de síntesis no ribosomal, betalactona y una nueva bacteriocina. Palabras clave: bacteriocinas, resistencia antimicrobiana, metabolitos especializados.

Antimicrobial resistance comprises a major public health problem worldwide. It is estimated that by 2050 there will be no effective antimicrobials to treat diseases caused by multi-drug resistant bacteria, especially in immunocompromised patients, drastically increasing the morbidity and mortality rates. Most of the antimicrobials used in medicine are produced by microorganisms. Therefore, research on specialized metabolites with antimicrobial functions produced by bacteria may lead to the development of new, effective antibiotics. In our research group, two bacteria isolated from the Mapocho River, in Santiago of Chile, display a potential for the production of antimicrobial compounds, evidenced by the growth inhibition of human bacterial pathogens. Through genome sequencing and phylogenetic analysis, these isolates were identified as Pseudomonas sp. I1 and Desemzia incerta I2. Nonetheless, their mechanisms of inhibition are still unknown. In this work, the determinants of inhibition capacity in the Pseudomonas sp. I1 genome were investigated. On the basis of his inhibitory activity, it is hypothesized that in the genome of this species are encoded proteins responsible for the synthesis of specialized metabolites and bacteriocins associated with the inhibition of the growth of microbial pathogens. To corroborate this hypothesis, genome mining techniques were applied to identify and characterize genes for the synthesis of specialized metabolites and bacteriocins of Pseudomonas sp. I1 putatively involved in the ability to inhibit the growth of pathogens. First, we identified hypothetical genetic clusters coding for the synthesis of specialized metabolites and bacteriocins in the genome of Pseudomonas sp. I1 using the genome mining programs antiSMASH and BAGEL4. Using The antiSMASH software the presence of 5 clusters with NRPS-like pathways for the production of lokisin, nunamycin, chichopeptin, and pyoverdine (2 clusters), in addition to a hypothetical pathway for production of a new betalactone, were detected. The analysis using BAGEL4 allowed the identification of three clusters that encode bacteriocins, all corresponding to S-type pyocins. Then, these clusters were characterized by comparisons with similar clusters in databases. These analyses determined that three of the NRPS clusters identified by antiSMASH, namely the lokisin, nunamycin and chichopeptin clusters, were not independent but comprise fragments of a single cluster whose products are involved in lokisin biosynthesis, located in different contigs. Furthermore, the two hypothetical pyoverdine clusters were determined to form a single pathway and to contain the genes whose products are essential for pyoverdine biosynthesis. The hypothetical betalactone cluster identified by antiSMASH may produce a new type of betalactone. While three hypothetical bacteriocins were identified, for two of them it was not possible to identify all the typical domains of S pyocins. The other bacteriocin has a new combination of domains not identified in the pyocins described so far and it was herein named pyocin S14. Using a BLASTP search, 20 homologs of the pyocin S14 were identified conserved in different species of Pseudomonas. Further, the pyocin S14 has a carboxyl-terminal domain that lacks the nucleases motifs described to date, therefore, it would represent a new family of DNases. In addition, 953 proteins that conserve the carboxyl-terminal domain of pyocin S14 in several bacterial species of γ-proteobacteria group were identified. A multiple alignment of these sequences identified 13 conserved amino acids that could be essential for the function of this new family of DNases. In conclusion, the genome of Pseudomonas sp. I1 has genes whose products may be associated with the synthesis of molecules with inhibitory potential, such as non-ribosomal synthesis peptides, betalactone and a new bacteriocin. Keywords: bacteriocins, antimicrobial resistance, specialized metabolites.