Localización tisular y celular del dimboa-glucosido y de B-glucosidasas en plantas de maíz (zea mays L.)

Abstract

La compartimentación de metabolitos secundarios en células vegetales, definida como el gradiente de concentración de un metabolito entre compartimientos separados por membranas, es un área poco estudiada en la fisiología vegetal. Un grupo importante de productos naturales está constituido por 1os ácidos hidroxámicos ciclicos (1,4-benzoxazin-3-ona) encontrados en gramíneas. De estos compuestos, el más abundante aislado de maiz y trigo es el DIMBOA (2,4-dihidroxi7-metoxi-2H-1, 4-benzoxazin-3[4H]-ona) al cual se le atribuye efecto pesticida debido a la toxicidad que presenta contra pestes y sobre reacciones de transferencia de energia en vegetales y animales mediante un mecanismo aparentemen te relacionado con la síntesis de ATP. Se ha informado que este compuesto se encuentra como glucósido en la planta intacta (2,4-dihidroxi-7-metoxi-2H-1,4-benzoxazin-3[4H]-ona-B-Dglucopiranósido). El daño tisular provocado por pestes o por ruptura mecánica, induciria la hidrólisis del DIMBOA-glucósido generando DIMBOA Y glucosa supuestamente por acción de Bglucosidasas. Este hecho permite postular que el DIMBOAglucósido estaría fisicamente aislado de las B-glucosidasas que 1o hidrolizan, ya sea en distintos tejidos o bien en distintos compartimientos dentro de la misma célula. La compartimentación propuesta explicaría la existencia de este glucósido in vivo en una forma que no afecta el metabolismo de la planta productora. El objetivo de esta tesis fue localizar tisular y celularmente al DIMBOA-glucósido y a las Bglucosidasas que lo hidrolizan utilizando un cultivar de maiz con alto contenido de este compuesto. Además, se estudió el efecto del glucósido y de la aglicona sobre mitocondrias Y cloroplastos aislados de la misma planta. Luego de aislar e identificar el DIMBOA-glucósido, se procedió a estudiar su efecto y el de DIMBOA sobre el transporte de electrones. Para ello, se midió el consumo de oxigeno de una preparación de mitocondrias en condiciones basales (NADH 1 mM o malato 50 mM), acopladas (ADP 2 mM) y desacopladas (2,4-dinitrofenol 50 µM). Se midió también la fotorreducción de un aceptor artificial de electrones (2,6- diclorofenol indofenol 200 µM) en preparaciones de cloroplastos. Tanto en mitocondrias como en cloroplastos se encontró que el DIMBOA inhibió la cadena transportadora de electrones a concentraciones muy inferiores a las potencialmente alcanzables por el cultivar utilizado. DIMBOAglucósido en cambio, no provocó ningún efecto sobre este proceso. Para el estudio de la compartimentación del DIMBOAglucósido y de las B-glucosidasas, se aislaron tejidos (parénquima mesofilico y haces vasculares) y fracciones celulares (protoplastos, vacuolas, mitocondrias y cloroplastos) en cada una de las cuales se estudió presencia de DIMBOA por HPLC y de B-glucosidasas por ensayos espectrofotométricos. Los resultados mostraron que tanto el glucósido como las B-glucosidasas se encuentran en todos los tejidos analizados, Sin embargo, se demostró que si bien ambos componentes coexisten dentro de una misma célula, DIMBOAglucósido se localiza en el citoplasma mientras que las DIMBOA-B-glucosidasas se encuentran dentro de la vacuola practicamente en su totalidad. Los resultados obtenidos permiten concluir que existe compartimentación celular en esta etapa del metabolismo de los ácidos hidroxámicos en maiz. Esta compartimentación regula la distribución de un compuesto potencialmente tóxico para su propio metabolismo mediante la separación del precursor glucosídico de las B-glucosidasas que lo activan.

The compartmentation of secondary metabolites, defined as concentration gradient of a metabolite between compartments separated by membranes, is an area scarcely studied in plant physiology. An important group of natural products is constituted by cyclic hydroxamic acids (1, 4-benzoxazine-3-one) found in graminae. From these compounds, the main one found in maize and wheat is DIMBOA (2,4-dihydroxy-7-methoxy-2H-1,4- benzoxazine-3[4H]-one) which has a possible role as pesticide due to its toxicity on pests and some animal and vegetal reactions probably through ATP synthesis. It has been reported that DIMBOA exists as glucoside (2,4-dihydroxy-7- methoxy-2H-1,4-benzoxazine-3[4H]-one-B-D-glucopyranoside) in intact plants. Tissue damage 1liberates DIMBOA and glucose from DIMBOA-glucoside through a hydrolytic process probably mediated by B-glucosidases. This observation may suggest that DIMBOA-glucoside should be physically isolated from hydrolytic B-glucosidases in a different compartment at tissular or cellular level. This compartmentation would explain the existence of glucoside in vivo without a harmfull effect on plant metabolism. The aim of this work was to localize the DIMBOA-glucoside and degrading B-glucosidases at tissular and cellular levels in maize plants. In addition, the effect of glucoside and its aglycone on mitochondria and chloroplasts isolated from the same plant was studied. DIMBOA-glucoside was purified from maize and chemically characterized. Its effects on electron-transfer chain were studied. Oxygen consumption by mitochondrial suspension was determined in basal (NADH 1 mM or malate 50 mM), coupled (ADP 2 mM) or uncoupled (2,4-dinitrophenol 50 µM) conditions. Photoreduction induced by a chloroplast suspension was studied by using an artificial electron acceptor (2,6-dichlorophenol indophenol 200 µM). In both, mitochondria and chioroplasts, DIMBOA had an inhibitory effect on the electron-transfer chain at a relatively low concentration compared with that found in maize leaves. On the other hand, DIMBOA-glucoside had no effect on this process. The compartmentation study of DIMBOA-glucoside and Bglucosidases was performed on tissues (mesophyll parenchyma and vascular cylinder) and cellular fractions (protoplasts, vacuoles, mitochondria and chloroplasts). In each fraction the content of DIMBOA was analized by HPLC and for B-glucosidases by spectrophotometric assays. The results showed that both components were present in all tissues studied. Nevertheless, inside the cell DIMBOA-glucoside was found in the cytoplasm and DIMBOA-B-glucosidases into vacuoles. The distribution observed for these components, supports compartmentation in this step of hydroxamic acids metabolism in maize. This cellular compartmentation wonld avoid the generation of DIMBOA and its potential toxic effect on the cel1, by isolation of its glucosidic precursor from degrading DIMBOA-B-glucosidases.