Linfocitos B de memoria en el Lupus Eritematoso sistémico

Abstract

Una de las funciones clave de los linfocitos B es la producción de anticuerpos, la cual es mediada por células plasmáticas y reforzada por la persistencia de sus precursores: los linfocitos B de memoria. Los linfocitos B de memoria que producen auto-anticuerpos patogénicos son considerados cruciales en el desarrollo y mantención de enfermedades autoinmunes. Los linfocitos B de memoria en humanos han sido caracterizados como células que expresan CD27 y moléculas propias de linfocitos B, sin embargo, en ratones no se conocen marcadores que permitan distinguir esta población. El conocimiento detallado del fenotipo de estas células de memoria puede contribuir al mejoramiento del desarrollo de vacunas y a un mayor entendimiento de las patologías autoinmunes. El lupus eritematoso sistémico (SLE) es una enfermedad autoinmune inflamatoria crónica de etiología desconocida caracterizada por la producción de autoanticuerpos que reconocen antigenos propios como el ADN de doble hebra y otros antígenos nucleares. Esto lleva a la formación de complejos inmunes que se depositan en diferentes órganos y tejidos y reclutan a agentes efectores inflamatorios adicionales, contribuyendo a la nefro-toxicidad característica del lupus. En este trabajo utilizamos un protocolo de inmunización estándar para caracterizar los linfocitos B de memoria en ratones, puesto que su fenotipo no ha sido del todo elucidado. Existen dos sub-poblaciones de linfocitos B de memoria: los linfocitos B de memoria clásicos IgM-IgD- y los linfocitos B de memoria IgM+ de larga vida. En este modelo encontramos que los linfocitos B de memoria activados producen IL-10, IL-6 y TNF. Los linfocitos B de memoria clásicos producen menos IL-10 e IL-6 que los linfocitos B de memoria IgM+. Los linfocitos B de memoria clásicos, a diferencia de los linfocitos B vírgenes, al ser activados in vitro expresan CD80, CD73 y PD-L2, marcadores asociados a memoria. Los linfocitos B de memoria IgM+ expresan menores niveles de estas moléculas. Posteriormente y como objetivo principal estudiamos las características de los linfocitos B de memoria de ratones que desarrollan lupus para determinar si estos son normales o se encuentran alterados. Para esto purificamos los linfocitos B de memoria a partir del bazo de un ratón lúpico y al activarlos encontramos un patrón similar de producción de citoquinas en comparación a los ratones inmunizados. Además encontramos que la población de linfocitos B de memoria clásicos activados expresa altos niveles de CD80 y CD73, sin embargo presenta una disminución en la expresión de PD-L2, cuya deficiencia podría reflejar fallas en mecanismos de supresión de la respuesta inmune, contribuyendo a la condición de autoinmunidad. Paralelamente estudiamos otras características que nos permitan comprender cuáles son los posibles defectos que presentan los linfocitos B de memoria en el lupus. Los ratones lúpicos presentan un incremento significativo en el porcentaje de linfocitos B de memoria clásicos en el bazo mientras que los linfocitos B de memoria IgM+ no presentaron diferencias significativas comparado a ratones controles. En ganglio mesentérico, placas de Peyer y ganglios periféricos el porcentaje de linfocitos B de memoria IgM+ aumenta comparado a ratones controles. El timo de ratones lúpicos presenta un aumento de linfocitos B totales y una disminución en los linfocitos B de memoria clásicos mientras que los linfocitos B de memoria IgM+ y los linfocitos B vírgenes aumentan. Los órganos linfoides secundarios de ratones lúpicos poseen un aumento exacerbado de linfocitos B GL7+ CD95+, los cuales forman centros germinales, donde se generan linfocitos B de memoria y células plasmáticas productoras de anticuerpos. En estos ratones además encontramos un incremento en el porcentaje de linfocitos B de la zona marginal de fenotipo CD21+ CD23- IgM+ CD1d+, los cuales al activarse producen IL-10 y formarían parte de la población de linfocitos B de memoria que mantienen el isotipo IgM+. La presencia de una mayor frecuencia de linfocitos B de memoria y de centros germinales en ratones lúpicos en conjunto con las características fenotípicas de las células encontradas en este trabajo podría dar cuenta de deficiencias en la mantención de la homeostasis del sistema inmune, contribuyendo al desarrollo de la patología del lupus.

One of the key functions of B lymphocytes is antibody production, which is mediated by plasma cells and reinforced by the persistency of their precursors: memory B cells. Memory В cells that produce pathogenic autoantibodies are considered to be very important in the development and maintenance of autoimmune diseases. In humans, memory B cells have been characterized as cells expressing CD27 and common markers of B cells, however, in mice there are no known markers that allow us to distinguish memory B cells. The detailed knowledge of the memory B cells phenotype can contribute to the development of better vaccines and to a better understanding of autoimmune pathologies. Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune inflammatory chronic disease of unknown etiology characterized by the production of auto-antibodies reacting against self antigens such as double stranded DNA and other nuclear antigens. This leads to the formation of immune complexes that are accumulated in different organs and tissues recruiting additional inflammatory effector agents that contribute to the characteristic nephro-toxicity of lupus. In this work we used a standard immunization protocol to characterize memory B cells in mice because their phenotype has not been completely elucidated. There are two subsets of memory B cells: memory B cells classically defined as IgM-IgD- and long- lived IgM+ memory B cells. In this model we found that activated memory B cells produced IL-10, IL-6 and TNF. Classic memory B cells produced less IL-10 and IL-6 than IgM+ memory B cells. Classic memory B cells, unlike naïve B cells, when activated in vitro expressed memory-associated markers CD80, CD73 and PD-L2. IgM+ memory B cells expressed lower levels of these molecules. We then studied the characteristics of memory B cells in lupic mice to determine if these are normal or altered. To do this we purified memory B cells from the spleen of a lupic mouse and activated them. We found a pattern of cytokine production similar to immunized mice and found that activated classic memory B cells expressed high levels of CD80 and CD73 but a decreased level of PD-L2. This deficiency could reflect failures in suppression mechanisms of the immune response, contributing to an autoimmune condition. We also studied other characteristics that could help us to understand the possible defects that memory B cells present in lupus. Lupic mice have a significant increase of the percent of classic memory B cells in spleen while IgM+ memory B cells do not present a significant difference when compared to control mice. The percentage of IgM+ memory B cells increases in mesenteric lymph node, Peyer patches and peripheral lymph nodes in contrast to control mice. The thymus of lupic mice presents an increase of total B cells and a decrease in classic memory B cells while IgM+ memory and naïve B cells are increased. Secondary lymphoid organs from lupic mice have an exacerbated increase of GL7+CD95+ B cells, which form germinal centers and generate classic memory B cells and antibody-producing plasma cells. In these mice we also found an increase in the percent of marginal zone B cells with a CD21+CD23-lgM-CD1d+ phenotype, which produce IL-10 when are activated and could form part of IgM+ memory B cell pool. The increase in the frequency of memory B cells and germinal centers together with the phenotype of memory B cells found in lupic mice could reflect deficiencies in homeostasis maintenance of the immune system, contributing to the development of the lupus pathology.