Estudio genético molecular del gen crtE involucrado en la ruta de biosíntesis de Astaxantina en Xanthophyllomyces dendrorhous

Abstract

Los terpenos son una amplia y variada clase de compuestos hidrocarbonados cuya unidad base es una molécula de 5 carbonos denominada isopreno. La síntesis de los terpenos comienza con la condensación del isopentenil difosfato (IPP) con su isómero dimetilalil difosfato (DMAPP) para formar el geranil difosfato (GPP). La elongación de la cadena hidrocarbonada se logra por la adición secuencial del IPP a los diferentes compuestos formados. La biosíntesis de los terpenos comienza en una etapa temprana con la biosíntesis del IPP, seguido de la elongación de la cadena hidrocarbonada hasta el diterpeno geranilgeranil difosfato (GGPP) en la etapa intermedia. La síntesis de carotenoides corresponde a la etapa tardía de síntesis de terpenos. En esta etapa, se adicionan o remueven grupos metilos y/o átomos de oxígeno a los diferentes terpenos. Algunos terpenos tienen un alto potencial biotecnológico por ser moléculas biológicamente activas, destacando dentro del grupo de los tetraterpenos los pigmentos carotenoides. Estos pigmentos son utilizados en la industria química como colorantes y en la industria farmacéutica como antioxidantes. La levadura basidiomicete Xanthophyllomyces dendrorhous sintetiza astaxantina como principal pigmento carotenoide, siendo utilizada en la industria acuícola como colorante para los salmones y en la industria farmacéutica como antioxidante. La producción industrial de astaxantina natural a partir de X. dendrorhous se ha visto limitada por la baja cantidad de pigmento producido por la cepa silvestre y el reducido conocimiento de su ruta de biosíntesis y de los factores que la regulan. Los estudios de la ruta de biosíntesis de la astaxantina en X. dendrorhous se han enfocado casi exclusivamente a la etapa tardía de la síntesis de los terpenos, correspondiente a la síntesis desde el fitoeno a la astaxantina. Sin embargo, en otros organismos se ha observado que las etapas previas tienen un rol fundamental en la cantidad final de pigmento producido. En el presente trabajo se estudió, desde el punto de vista genético-molecular, la etapa intermedia de biosíntesis de terpenos en X. dendrorhous, correspondiente a la biosíntesis de GGPP a partir del IPP y DMAPP. Para esto, se determinó mediante PCR la presencia en X. dendrorhous de los genes crtE y FPS, los cuales codificarían a las enzimas GGPP sintasa y FPP sintasa, respectivamente. Además, se ubicó por hibridación la posición relativa del gen crtE en un fragmento BamHI de 11.429 pb en el genoma de X. dendrorhous, el cual fue clonado y secuenciado completamente. El análisis de las secuencias permitió definir el tamaño del marco abierto de lectura del gen crtE en 2.053 pb y que éste se encontraría potencialmente ligado a los genes UBL y RPL19. Adicionalmente se clonó, por RT-PCR, un fragmento de 1.131 pb correspondiente al cDNA del gen crtE, definiendo mediante la comparación entre las secuencias del cDNA y el gDNA la presencia de 9 exones y 8 intrones. Además, se demostró la actividad GGPP sintasa de la enzima codificada por el gen crtE de X. dendrorhous mediante ensayos de complementación heteróloga en una cepa de Escherichia coli portadora del clúster carotenogénico de Erwinia uredovora carente de la actividad GGPP sintasa. Finalmente, se obtuvieron cepas de X. dendrorhous heterocigotas para el gen crtE, que presentaron una disminución de un 42% de la producción total de pigmento, demostrando la importancia de la etapa intermedia de la síntesis de terpenos en la producción final de astaxantina.

The terpenes are a wide and varied class of hydrocarbonated compounds whose basic unit is a 5 C molecule called isoprene. The terpenes synthesis begins with the condensation of isopentenil diphosphate (IPP) with its isomer dimethylallyl diphosphate (DMAPP) to form geranyl diphosphate (GPP). The elongation of the hydrocarbonated chain is accomplished by the sequential addition of IPP to different compounds formed. In an early stage, terpenes biosynthesis begins with the biosynthesis of IPP, followed by the elongation of the hydrocarbonated chain until the diterpene geranylgeranyl diphosphate (GGPP) is formed in the intermediate stage. Carotenoids synthesis corresponds to the late stage. In this stage, modifications are carried out by adding or removing methyl groups and/or oxygen atoms on the different terpenes. Some terpenes have a high biotechnological potential since they are biologically active molecules. The carotenoid pigments are particularly important within this group. These pigments are used in the chemical industry as colorants and the pharmaceutical industry as antioxidants. The basidiomycetous yeast Xanthophyllomyces dendrorhous synthesizes astaxanthin as its main carotenoid pigment, which it is used in the aquaculture industry as colorant for salmon and in the pharmaceutical industry as antioxidant. The industrial production of natural astaxanthin from X. dendrorhous has been limited due to the low quantity of pigment produced by the wild type strain and the reduced knowledge of its biosynthesis pathway and the factors that regulate it. The studies of the astaxanthin biosynthesis pathway in X. dendrorhous have been focused almost exclusively to the late stage of the synthesis of terpenes, corresponding to the synthesis of phytoene to astaxanthin. However, in other organisms it has been observed that the previous stages have a fundamental role in the final amount of pigment produced. In the present work, the intermediate stage of the biosynthesis of terpenes corresponding to the biosynthesis of GGPP from IPP and DMAPP in X. dendrorhous was studied from a molecular-genetic point of view. For this, were identified by PCR the presence of the crtE and FPS genes in X. dendrorhous which would encode the GGPP synthase and FPP synthase enzymes, respectively. Furthermore, the crtE gene is in an 11.429 bp BamHI fragment and its localization in the yeast genome was determined by hybridization. The crtE gene was cloned and sequenced completely. The sequence analysis indicated that the crtE gene has a 2.053 ORF and it is potentially linked to the genes UBL and RPL19. Additionally, a 1.131 bp fragment corresponding to the cDNA of the crtE gene was cloned by RT-PCR defining by comparison between the cDNA and gDNA sequences the presence of 9 exons and 8 introns. Moreover, the GGPP synthase activity of the enzyme encoded by the crtE gene of X. dendrorhous was shown by heterologous complementation assays in an Escherichia coli strain that carries the carotenogenic cluster of Erwinia uredovora and lacks the GGPP synthase activity. Finally, heterozygous X. dendrorhous strains for the crtE gene were obtained. These showed a 42% decrease in total pigment production, showing the importance of the intermediate stage of the synthesis of terpenes in the final production of astaxanthin.