Células estromales en cultivo obtenidas de órganos linfoides secundarios : un modelo para estudiar la participación de los receptores de adhesión en las interacciones linfocitos-estroma

Abstract

Las interacciones adhesivas entre los linfocitos y las células del microambiente de los órganos linfoides secundarios (OLS) son importantes, tanto en la migración de los linfocitos a los OLS, como también, en la proliferación y diferenciación de los linfocitos. Sin embargo, los modelos hasta ahora utilizados para estudiar estas interacciones son escasos o no incluyen a células estromales purificadas. Para investigar los receptores de adhesión involucrados en el establecimiento de interacciones entre los linfocitos y las células estromales de los OLS, hemos desarrollado modelos de adhesión in vitro utilizando bazo murino y amígdala humana. Sistema murino: A partir de cultivos primarios de bazo hemos aislado y mantenido dos líneas de células estromales, B-1 y B-2, respectivamente con uno y dos tipos celulares morfológicamente distintos. Tanto los estromas completos, como las células adherentes derivadas de B-1 y B-2, se utilizaron en estudios de adhesión de linfocitos de ratón. También, hemos desarrollado un modelo xenogeneico para identificar los receptores de adhesión utilizados por linfocitos humanos en su interacción con las células estromales de bazo murino. El análisis por citometría de flujo indicó que las células de B-1 y B-2 expresan en su superficie a las moléculas CD44 y VCAM-1. El cultivo B-2 presenta al menos dos tipos de células, debido a que un porcentaje de las células presenta receptores Fc y la molécula CD11b. No se encontraron marcadores para células dendríticas interdigitantes, dendríticas foliculares o macrófagos. Lo anterior sugiere la presencia de células reticulares en estos cultivos. Las células mononucleares (MNC) preparadas de bazo de ratón se adhieren a los estromas completos de bazo y a las células de B-1 y B-2 en un 30-40%. La activación de MNC con ConA (pero no con LPS) aumentó la unión a los estromas completos por un factor de dos. En cambio, la adhesión de MNC a B-1 y B-2 no cambió después de activación. Los linfocitos B se adhieren a los estromas completos y a las células de B-1 y B-2 en un 25%, 17% y 35% respectivamente, mientras que las células T se unen aproximadamente en un 12% a los tres estromas. Luego de activación con ConA, la adhesión de los linfocitos T aumentó en un factor de tres. La adhesión de la línea celular humana Daudi a cultivos de B-1 y B-2 fue inhibida por un anticuerpo dirigido a la subunidad a4 de las integrinas B1 (humana) en un 95% у 60% у por un anticuerpo anti-VCAM-1 (murino) en un 80% y un 50%, respectivamente. También, la adhesión de la línea celular Ramos a B-2 fue inhibida por los anticuerpos anti-a4 y anti-VCAM-1 en un 75% y un 50%, respectivamente. Estos resultados sugieren que los linfocitos humanos emplean el par VLA-4/VCAM-1 para unirse a las células estromales de bazo. Por otra parte, aunque la adhesión de la línea celular Daudi a los estromas completos de bazo fue bloqueada por el anti-VCAM-1 murino en un 60%, el anticuerpo anti-04 humano no bloqueó esta adhesión. Se concluye que en cultivo las células adherentes de bazo murino son un modelo válido para estudiar las interacciones linfocitos humanos-células estromales de bazo. Nuestros resultados sugieren que los linfocitos emplean el par VLA-4/VCAM-1 para unir a las células estromales de bazo. Sistema humano: A partir de cultivos primarios de amígdalas humanas se aisló una población homogénea de células adherentes (AMG). El análisis por FACScan demostró que éstas corresponden a células endoteliales de vénula, debido a su reacción positiva para el factor de von Willebrand y LVAP2, una molécula presente exclusivamente en endotelio de vénulas. Las células son negativas para marcadores presentes en células dendríticas interdigitantes, dendríticas foliculares o macrófagos. Expresan ICAM-1, VCAM-1, CD40 у luego de inducción por IFN-y, expresan antígenos MHC clase II. A diferencia de las células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC), el modelo clásico de estudio in vitro, las células AMG no necesitan ser activadas por citoquinas para unir células linfoides via VLA-4. Los anticuerpos anti-a4 y anti-ẞ1, bloquearon la adhesión de la línea celular RAMOS a HUVEC tratadas con TNF-a y a AMG no tratadas. Por otra parte, un anticuerpo anti VCAM-1 que bloquea la adhesión de RAMOS a HUVEC tratadas con TNF-a, no bloqueó la adhesión de estas células a AMG, sugiriendo la presencia sobre las células endoteliales de amígdala de un ligando de VLA-4 diferente de VCAM-1. Nuestros datos indican que este ligando no sería fibronectina. La adhesión de la línea celular DAUDI a AMG y el efecto de los anticuerpos anti-a4 y antiVCAM-1, en esta adhesión, fortalece la idea de un ligando de VLA-4 distinto de VCAM-1 y de fibronectina. Se concluye que las células endoteliales de amígdala humana son un modelo útil para estudiar las interacciones de los linfocitos con el endotelio linfoide puesto que pueden ser mantenidas en cultivo en un estado adhesivo funcional.

The adhesive interactions between lymphocytes and the cells conforming the microenvironment of secondary lymphoid organs (SLO) are essential for lymphocyte migration as well as lymphocyte proliferation and differentiation. However, present models utilized to study these interactions are sparing and do not include purified stromal cells. To investigate the adhesion receptors involved in the establishment of the interactions between lymphocytes and stromal cells in SLO, we have developed adhesion models in vitro with stromal cells from mouse spleen and human tonsil. Murine system: Starting from primary spleen cultures we have isolated and maintained two stromal cell lines, B-1 and B-2, with one and two morphological cell types respectively. We have used complete stromas as well as the two derived adherent cell cultures, B-1 and B-2, in adhesion studies of murine lymphocytes. Also, we have developed a xenogeneic model to identify the adhesion receptors utilized by human lymphocytes in their interaction with murine spleen stromal cells. Flow cytometry analysis indicates that the B-1 and B-2 cells express CD44 and VCAM-1 molecules in their surface. The B-2 culture presents at least two types of cells as indicated by the presence, in a percentage of the cells, of Fc receptors and the CD11b molecule. These cells are negative for characteristic markers of interdigitant dendritic cells, follicular dendritic cells or macrophages . These results suggest the presence of reticular cells in these cultures. Mononuclear cells prepared from murine spleen adhere to the complete spleen stromas and to the B-1 and B-2 cell lines by 30-40-%. Activation of mononuclear cells with ConA (but not with LPS) increases binding to complete stromas by a factor two. In contrast, adhesion of mononuclear to the B-1 and B-2 does not change after activation. Isolated B lymphocytes adhere to the complete stromas and to the B-1 and B-2 cultures by 25%, 17% and 35% respectively, while T cells bind by aproximately 12% to all three stromas. After activation with ConA the T lymphocytes adhesion increases by a factor three. Adhesion of the human DAUDI cell line to B-1 and B-2 cultures was inhibited by an antibody to the a4 subunit of human ẞ1 integrins by 95% and 60% and by an anti-(murine) VCAM-1 antibody by 80% and 50% respectively. Also, adhesion of the RAMOS cell line to B-2 cells was inhibited by anti-a4 and anti-VCAM-1 antibodies by 75% and 50% respectively. These results suggest that lymphocytes use the VLA-4/VCAM-1 pair to bind to spleen stromal cells. On the other hand, although adhesion of the DAUDI cell line to complete spleen stromas was blocked by the anti-(murine) VCAM-1 by 60%, was not blocked by the anti-(human) a4 antibody. It is concluded that adherent murine spleen cells in culture are a valid model to study human lymphocyte-spleen stromal cell interactions and that human lymphocytes employ the VLA-4/VCAM-1 pair to bind to spleen stromal cells. Human system: Starting from primary cultures of human tonsils we isolated a homogeneus population of adherent cells (AMG). FACScan analyses demonstrate that these cells correspond to endothelial venule cells. They are positive for von Willebrand factor and LVAP2, a molecule present in endothelial venule cells. The cells are negative for markers present in interdigitant dendritic cells, follicular dendritic cells and macrophages. They express ICAM-1, VCAM-1, CD40 and can be induced by IFN-y to express MHC class II antigens. As opposed to endothelial cells from human umbilical cord (HUVEC), the classic model for in vitro adhesion studies, the AMG cells do not need to be activated by cytokines to bind lymphoid cells via VLA-4. Anti-a4 and anti-ẞ1 antibodies block adhesion of the RAMOS cell line to TNFa treated HUVEC and to untreated AMG. On the other hand, an anti-VCAM1 antibody that blocks adhesion of RAMOS to TNF-a treated HUVEC, does not block adhesion of these cells to AMG, suggesting the presence on the tonsillar endothelial cells of a ligand for VLA-4 different from VCAM-1. Our data indicate that this ligand is not fibronectin. Adhesion of the DAUDI cells to AMG and the effect of the anti-c4 and anti-VCAM-1 antibodies on this binding strengthen the idea of a VLA-4 ligand different from VCAM-1 and fibronectin. The demonstration that endothelial cells from human tonsils can be maintained in a functional adhesive state in culture provides a useful model to study lymphocyte-lymphoid endothelium interactions.