Identificación y caracterización funcional de los elementos genéticos extracromosómicos del tipo dsaRNA en Xanthophyllomyces dendrorhous

Abstract

Xanthophyllomyces dendrorhous es una levadura basidiomicete aislada desde distintas regiones frías del planeta y que se caracteriza por producir astaxantina, un pigmento utilizado en la industria acuícola y farmacéutica. En la mayoría de las cepas de esta levadura se describió la presencia moléculas de RNA de doble hebra (dsRNA) y partículas tipo virus (VLPs). Este tipo de Elementos Genéticos Extracromosómico es comúnmente encontrado en levaduras y hongos filamentosos, los cuales se encuentran encapsidados en VLPs. Las investigaciones realizadas en la levadura Saccharomyces cerevisiae permitieron identificar a los dsRNAs como micovirus dando origen al género Totivirus, cuyos miembros poseen genomas no segmentados con dos marcos de lectura abiertos sobrepuestos, que codifican para la proteína de la cápside y para una RNA polimerasa viral. Algunos aislados de S. cerevisiae que tienen un fenotipo conocido como "killer" (capacidad de matar a otras levaduras) además poseen otros dsRNAs M-dsRNA que codifican para una micotoxina y la inmunidad a la misma. Estos M-dsRNAs son considerados elementos llamados "satélites" porque dependen de las proteínas virales codificadas por el genoma viral para su replicación y mantenimiento, conformando de esta forma un sistema viral conocido como helper/satélite. En las diferentes cepas de X. dendrorhous existe una alta variación en el número y tamaño de las moléculas de dsRNAs presentes, incluso existiendo una relación con el origen geográfico. En estudios realizados por nuestro grupo con la cepа UCD 67-385, que posee 4 dsRNAs de diferente tamaño, se logró identificar tres genomas de Totivirus distintos. En el presente trabajo se realizó una caracterización molecular y funcional de los dsRNAs presentes en cinco cepas de X. dendrorhous que se diferencian el tipo de dsRNAs que contienen, de acuerdo con su tamaño. En cada cepa se evaluó la existencia de dsRNAs virales y satélites, la encapsidación de los dsRNAs en partículas virales y la posible participación de estos en la producción de micotoxinas. Se realizaron ensayos de actividad antifúngica de X. dendrorhous contra diferentes especies de levaduras, y si bien se detectó actividad, ésta no se pudo correlacionar con la presencia de los dsRNAs. Los análisis moleculares permitieron identificar distintos genomas de Totivirus en los aislados, los que pueden coexistir además con dsRNAs satélites. Desde cultivos de cada cepa se purificó y separaron las partículas virales por densidad usando gradientes de sacarosa y en cada fracción obtenida se determinó el contenido de dsRNA y proteínas. Tal como ocurre en el sistema helper/satélite descrito en S. cerevisiae, los distintos dsRNAs estarían encapsidados separadamente en las partículas virales, las que estarían principalmente constituidas por una proteína de 76 o 37 kDa apróx, según el genoma viral presente. La cepa UCD 67-385 es la única en que se observan ambas proteínas, cuyo tamaño estimado coincide con el predicho para la proteína de la cápside codificada por los tres genomas virales identificados. La identidad de estas proteínas se confirmó por MALDITOF/MS, encontrando además en sus secuencias múltiples segmentos de estructura secundaria característicos de las proteínas de la cápside y aminoácidos que son conservados en los Totivirus. La existencia de partícula tipo virus en los aislados que contienen sólo una o ambas proteínas virales (76 y/o 37 kDa) se determinó por microscopía electrónica, observando partículas con diámetros que variaron (40, 26 y 36 nm) según la proteína Gag que las conforma. Con los resultados obtenidos en este trabajo se logró describir por primera vez la presencia de un sistema viral compuesto por genomas virales y dsRNAs satélites en X. dendrorhous, demostrando la coexistencia de hasta tres Totivirus diferentes en un mismo hospedero, fenómeno que es inusual en levaduras. Estos virus son los responsables de generar las proteínas virales necesarias para para la encapsidación de todos los dsRNAS, permitiendo la mantención y propagación de estos elementos en los distintos aislados de la levadura.

Xanthophyllomyces dendrorhous is a Basídiomycetous yeast isolated from cold regions of the planet, which have the characteristic to produce astaxanthin, a pigment used in aquaculture and pharmaceutical industry. Most strains of this yeast have double-stranded RNA (dsRNA) molecules and virus like particles (VLPs), an extrachromosomal genetic element commonly found in yeasts and filamentous fungi. Studies performed in Saccharomyces cerevisiae conducted to the identification of dsRNAs as viral genomes giving origin to the Totivirus genus, whose members are characterized by have unsegmented genomes with two overlapped open reading frames encoding for a capsid protein and a RNA-dependent RNA polymerase. Strains of S. cerevisiae that have a "killer" phenotype (ability to kill other yeasts), furthermore have dsRNAs of minor sizes called M-dsRNA, which encodes for a mycotoxin and selfimmunity. The M-dsRNA is classified as a "satellite" element because depends on viral proteins encoded by the totiviruses for its replication/propagation, conforming in this way an helper/satellite virus system. There is a high variation in the number and sizes of dsRNAs among the different strains of X. dendrorhous, even there exists a correlation with the geographic origin of isolation. In studies of our group with the strain UCD 67-385 that has four dsRNAs, three different Totivirus were identified. In this work, the dsRNAs of five strains of X. dendrorhous were studied in relation to their encapsidation into viral particles and involvement in mycotoxins production, and were characterized at molecular level. The antifungal activity of X. dendrorhous was assayed against different yeast species, finding no correlation between the antimicrobial activity and the presence of dsRNAs. The molecular analysis suggests the existence of different Totivirus genomes in all X. dendrorhous strains studied, which coexist with probable satellite dsRNAs in some strains. The virus-like particles were purified and separated by sucrose gradients, and the content of dsRNA and protein were determined in the fractions obtained. Similar to helper/satellite viral system described in S. cerevisiae, the dsRNAs of X. dendrorhous would be separately encapsidated into viral particles, which are formed by a protein of 76 or 37 kDa approx. according to the viral genome present in the strain. Only in the strain UCD 67-385 it appeared both proteins, whose estimated size matches with these ones predicted for capsid protein encoded by the viral genomes identified in this strain. The identity of these proteins was confirmed by MALDI-TOF/MS and multiple segments of secondary structure were founded in capsid protein sequences, while the conserved amino acids of the Totivirus also were identified. Under electron microscopy, the VLPs were determined appear with morphology similar of the Totivirus, with diameters of 36, 40 and 26 nm, for VLPs associated to 37 kDa, 76 kDa and both proteins. With the results obtained in this work, we described for first time the existence of a Helper/satellite viral system in X. dendrorhous, demonstrating the coexistence of three different Totivirus on the same host, which is unusual phenomenon in yeast. These viruses are responsible for generating all viral proteins necessary for dsRNAs encapsidation, allowing the maintenance and propagation of these elements in the different isolates of X. dendrorhous.