Mecanismo de exportación y procesamiento de la microcina E492

Abstract

La microcina E492, una bacteriocina formadora de poros, es producida y secretada por Klebsiella pneumoniae RYC492. El sistema genético de la microcina se clonó en Escherichia coli obteniéndose una microcina recombinante con las mismas propiedades que la producida por K. pneumoniae. Este antibiótico es sintetizado como un precursor, con un péptido líder (PL) N-terminal que es procesado concomitantemente con la exportación hacia el medio extracelular. El PL de la microcina E492 es del tipo doble glicina, lo que indica que la microcina E492 sería exportada a través de un aparato transportador ABC dado que comúnmente este sistema transportador es el encargado de exportar proteínas con esta clase de PL. El objetivo de este trabajo fue estudiar el procesamiento y exportación de la microcina E492. Mediante la caracterización de mutantes por transposición en el sistema genético de la microcina se estableció que participan tres genes en la exportación de la microcina: mceG, que codifica para el transportador ABC, mceH, para la proteína accesoria y mceF, para un factor adicional nunca antes descrito, por tanto, de función desconocida. Los aparatos transportadores ABC además están normalmente constituidos por una proteína localizada en la membrana externa. Para determinar cual es la proteína de membrana externa que forma parte el aparato transportador ABC de la microcina se utilizó una mutante en el gen tolC. La mutante tolC¯ no es capaz de exportar microcina, función que recupera al ser transformada con un plásmido que lleva el gen tolC. Así, TolC es la proteína de membrana externa que forma parte del aparato transportador ABC de la microcina en E. coli. Las proteínas candidatas de procesar el PL de la microcina son MceG y MceF. Proteínas homólogas a MceG poseen un dominio N-terminal encargado de procesar el PL. Por otro lado, la secuencia de MceF sugiere que sería una proteasa de membrana interna y una mutante carente de MceF produce una proteína de un tamaño superior que correspondería a la microcina no procesada. Los estudios de western blot de medios sobrenadantes y de fracciones totales y subcelulares obtenidos de las mutantes mceG¯ y mceF¯ indican que MceG procesa el PL de la microcina conjuntamente con MceF. Aparentemente MceF interviene en el reconocimiento junto con MceG de la microcina precursora y facilitaría que el dominio de líder-peptidasa de MceG encuentre a la microcina precursora para procesarla. MceG y MceH presentan una identidad cercana al 90% con el transportador ABC de la colicina V (CvaB) y su proteína accesoria (CvaA). En este trabajo se estudió la relación funcional que existe entre el sistema transportador de la microcina E492 y de la colicina V y sus respectivos péptidos líder tratando de establecer el papel que juega MceF en este proceso. Se realizó un análisis funcional combinando los componentes del sistema exportador de la microcina y de la colicina V, cuyo resultado indica que la colicina V puede emplear el transportador ABC y la proteína accesoria de la microcina E492 para su secreción únicamente cuando está presente la proteína MceF. Por el contrario, la microcina E492 no puede usar el transportador de la colicina V para alcanzarel medio extracelular, y la proteína accesoria CvaA complementa parcialmente la falta de su homólogo MceH en la exportación de la microcina E492. Así, la complementación funcional no es recíproca aún cuando la similitud entre ambos sistemas es muy alta y la exportación vía MceGH de ambas bacteriocinas requiere de MceF. La secuencia del PL de la microcina presenta en común cinco de los nueveaminoácidos conservados en la secuencia consenso de esta clase de péptidos líder. Los aminoácidos que difieren pueden ser importantes para el procesamiento, como la glicina en la posición –1, ya que los residuos más importantes del PL del tipo doble glicina son las dos glicinas ubicadas en las posiciones -1 y –2. La microcina presenta una alanina en la posición –1, en cambio la colicina V posee la mayoría de los aminoácidos de consenso incluyendo las dos glicinas mencionadas. Se construyeron proteínas quimeras fusionando el PL de la colicina V a la microcina madura y viceversa con el fin de determinar la importancia de los aminoácidos no conservados en el PL de la microcina y la relación que puede haber con MceF. La microcina quimera fue exportada por ambos sistemas exportadores en conjunto, en cambio, la colicina V quimera, a través de su propio aparato transportador. Comúnmente las señales de exportación que dirigen el tránsito hacia el medio extracelular de las proteínas exportadas por sistemas transportadores ABC están ubicadas en el extremo C-terminal. Sin embargo el PL podría también dirigir la exportación de estas proteínas. Se estudió el rol que tiene el PL en la exportación de la microcina clonando el gen de la microcina sin PL en un vector que permite modular la expresión del gen. Al expresar el gen, no se detectó microcina extracelular, además las células crecieron deficientemente, sobreviviendo solo las que lograron rearreglar su DNA, excluyendo el fragmento perjudicial. En el experimento control con PL, la microcina pudo ser exportada y las células crecieron saludables. Esto indica que el PL dirige la exportación de la microcina y evita el efecto deletéreo de ella sobre la célula.