Relaciones morfológicas y fisiológicas de células horizontales de cyprinus carpio: registro y marcación intracelular in vivo con trazadores enzimáticos

Abstract

Las células horizontales (CH) son neuronas de segundo orden que establecen sinápsis laterales en la retina de los vertebrados. Están dispuestas tangencialmente entre las capas granular y plexiforme externas. Por razones de conveniencia, su estudio ha sido realizado de preferencia en preparaciones in vitro de retina de poiquilotermos, especialmente de teleósteos. Las CH de éstos se caracterizan por tener un axón fino y largo que termina en un ensanchamiento fusiforme. En Carassius (pez dorado) se ha clasificado a las CH en tres clases morfológicas (H1, H2 y H3), según el tamaño relativo del soma y la extensión del árbol dendritico. Sus respuestas eléctricas asi como las de CH de carpa (Cyprinus carpio) ante estimulos cromáticos también han sido clasificadas en tres tipos, sugiriéndose la existencia de una relación entre morfologia y respuesta considerada válida para todos los teleósteos. Con el propósito de obviar las limitaciones de las preparaciones aisladas, se procedió a inyectar peroxidasa de rábano (HRP) en CH identificadas por sus respuestas, en retinas de carpas vivas, paralizadas y mantenidas artificialmente en buenas condiciones fisiológicas. Después de varias horas de sobrevida, sus retinas fueron extraidas у procesadas con diaminobencidina. Se logró asi, por primera vez, obtener células marcadas completas con ensanchados. Consistentemente, las imágenes sus axones obtenidas mostraron grupos de CH de los diferentes tipos morfológicos en configuraciones múltiples, sugerentes de formas particulares de asociación entre ellas. Se evaluó la posible incidencia de artificios experimentales en la obtención de dichas configuraciones múltiples, concluyéndose que sólo es explicable mediante la existencia de algún mecanismo de paso transneuronal de la enzima. Estos resultados revelan el valor potencial de la HRP como trazador neuronal en el interior de la retina. Se revisó la morfologia de estas células por su importancia determinante en la relación forma respuesta y en la clasificación morfológica propiamente tal. Para ello se definió un índice eidométrico (Ie = P/2√n A ) que permite determinar objetiva y cuantitativamente el aspecto de una CH. De la población de CH marcadas con HRP, 242 fueron dibujadas en cámara lúcida y sus contornos digitalizados. Se midió el perimetro P yel área A para calcular Ie. El histograma de frecuencias de Ie reveló una distribución bimodal, con un modo ajustado a una función de tipo lognormal y el otro en el limite de significación del test de Kolmogorov-Smirnov para la misma distribución. El primer grupo incluye al tipo morfológico Hl y el segundo, a H2 y H3. Estos resultados se compararon con los Ie obtenidos de micrografias de CH de carpa y pez dorado publicadas para apoyar la clasificación vigente, encontrándose que en el caso del pez dorado la clasificación en tres clases surge de inmediato, pero para la carpa hay un estrecho acuerdo con los resultados aquí presentados. Se concluyó que en la retina de la carpa hay sólo dos poblaciones morfológicas de CH. Todo parece indicar que la morfologia de estas células es especie dependiente. Como consecuencia, fue preciso revisar la supuesta relación biunívoca entre forma y respuesta. Se encontraron suficientes ejemplos de respuestas de CH discrepantes con sus tipos morfológicos, lo que obliga a concluir que las relaciones asignadas no son definitivas y, al menos para la carpa, dichas relaciones deben ser reexaminadas.

Horizontal cells (HC) are second order neurons establishing lateral connections in the vertebrate retina. They are tangentially disposed between the external granular and external plexiform layers. By reasons of convenience, their study has been mostly realized on in vitro preparations of poikilotherms, specially teleost retinas. A single thin and long axon ending in a fusiform expansion is a characteristic feature of the teleost's HC. In Carassius (goldfish) HC have been classified into three morphological types (H1, H2 and H3), according to the relative size of the soma and the extension of the dendritic tree. The electrical responses of carp HC to chromatic stimuli have also been classified into three kinds; hence, the existence of a relationship between morphology and responses was proposed, and has been considered valid for all teleosts. In order to obviate the limitations of the isolated retina preparation, horseradish peroxidase (HRP) was injected into HC identified by their responses, in the retina of paralized and artificially maintained live carps (Cyprinus carpio). After several hours of overlife, their retinas were excised and processed by the diaminobencidine method. In this way, and for the first time, complete HRP labeling of cells with their expanded axons could be obtained. However, instead of single isolated cells, images showed several HC of different morphological classes in varied configurations, suggesting particular forms of association among them. The possible incidence of experimental artifacts on these results was evaluated, concluding that they could be best explained by the existence of some mechanism of transneuronal migration of the enzyme. These results reveal the potential value of the HRP as a neuronal tracer within the retina. The large reevaluation population of labeled HC permited a on a firmer basis of their morphological distribution, of determinant importance concerning the assumed morphology-response relationship. For this purpose, an eidometric index (Ie = P/2√ A) was defined that could objectively and quantitatively determine the aspect of an HC. Thus, 242 HRP labeled HC were drawn by means of a camera lucida and their contour digitalized. The perimeter P and the area A were measured to calculated Ie. The frequency histogram of Ie revealed a bimodal distribution. One of the modes was closely fitted by a lognormal function, and the other mode at the significance limit given by the Kolmogorov-Smirnov test for the same distribution. The first group include the morphological type H1 and the second, types H2 and H3. These results were compared to those obtained from micrographs of HC from both carp and goldfish, published in support of the actual classification. Goldfish data fitted the classification onto three classes. Carp data, instead, accorded rather to the results presented here, which lead us to conclude that there are only two morphological groups in the carp retina. The morphology of these cells thus appears to be more strongly species-dependent than previously assumed. Consequently, the assumed biunivocal relationship between morphology and responses was examined. Several examples of HC responses in discrepancy with their morphological classes were found, forcing us to conclude that the assigned relations are not definitive and, at least for the carp, should be reexamined.