Identificación de los determinantes moleculares claves para la función de Bcl-2 en la membrana mitocondrial externa

Abstract

Bcl-2 es una proteína anti-apoptotica que previene la salida factores pro-apoptoticos, como el citocromo c (cit c) y el factor inductor de ]a apoptosis (AIF), desde la mitocondria durante el proceso de muerte celular programada o apoptosis. Sin embargo, adn se desconoce el mecanismo molecular mediante el cual Bcl-2 regula la permeabilidad de la membrana mitocondrial a estos factores pro-apopt6ticos. En condiciones fisiologicas, Bcl-2 se encuentra anclada principalmente en la membrana mitocondrial externa (MME), y en menor proporci6n, en la membrana del retículo endoplasmático y en la envoltura nuclear. La particular distribucion intracelular de Bcl-2 parece estar regulada por su extremo C-terminal. Este dominio esta compuesto en un 90 % por aminoácidos apolares, Ios que en contacto con la bicapa lipídica permiten el anclaje de esta proteína en membranas intracelulares. Bcl-2 esta compuesta 4 dominios BH (BH: Bc/-2 homo/ogy doma/.n) que son conservados entre miembros de la familia Bc]-2. Los dominios BH permiten la interaccion proteína-proteína entre miembros de la familia. La estructura en solucion de Bcl-2 predice que el plegamiento de los dominios BH1, BH2 y BH3 forma un bolsillo hidrof6bico (23), el cua[ es un sitio de uni6n para el dominio BH3 de proteínas pro-apoptoticas de la familia Bcl-2, como Bax (40). Estudios muta genéticos en el dominio BH3 de Bcl-2 y de Bax, sugieren que es un dominio clave para la interacci6n de estas proteinas (45). Sin embargo, estos estudios del dominio BH3 se realizaron considerando las mol6culas en soluci6n, Io cual no necesariamente representa

lo que ocurre cuando estas proteínas se encuentran asociadas a la MME. Probablemente, la inserci6n de Bcl-2 en la MME induce la re-estructuracion de la mol6cula, por lo que la interacci6n con el dominio BH3 de Bax no ocurriria como lo plantean los modelos en solución. Por otro lado, la funci6n del extremo C-terminal de Bcl-2 no soIo seria destinar la proteína a organelos intracelulares, si no que tambion, seria regular su actividad al participar directamente en el mecanismo de interaccion con proteínas pro-apoptoticas. Proponemos que el domino BH3 y el extremo C-terminal de Bcl-2 participan en el control de la permeabilidad de la membrana mitocondrial. Para comprobar nuestra hipotesis, se combin6 Ia expresion y purificacion de proteínas recombinantes, con ensayos de [iberaci6n de la proteína cit c, entrecruzamiento de proteínas y co-inmunoprecipitacion. inicialmente, estudiamos el papel del domino BH3 en la funci6n de Bcl-2, para lo cual se utilizo el inhibidor estructural, antimicina A3. Este compuesto, se une al bolsillo hidrofobico de Bcl-2, bloqueando el sitio de interacci6n con otras proteínas. Para explorar la participación del extremo C-terminal de Bc]-2 en la modulaci6n de ]a permeabilidad mitocondrial, se purificaron dos mutantes a las cuales se les eliminaron 11 (Bcl-2AC11) y 21 (Bcl 2AC21 ) residuos de sus extremos C-terminal y se ensayo la capacidad de estas de interaccionar con la membrana mitocondrial e inhibir la salida del cit c inducida por Bax. Consistente con su funci6n pro-apoptotica, nuestros resultados muestran que, Bax recombinante se asocia a la membrana mitocondrial y promueve de manera dependiente de la concentraci6n, la liberaci6n del cit c xiii desde mitocondrias purificadas. Por otro lado, Bcl-2 purificada suprime la accion de Bax en mitocondrias aisladas, efecto que es bloqueado por antimicina A3. Interesantemente, Bcl-2AC11 y Bcl-2A21 mantuvieron la capacidad de interaccionar con la membrana mitocondrial al igual que la proteína de largo total. Sin embargo, las mutantes en e] extremo C-terminal no inhiben la accion de Bax con la misma eficacia que Bcl-2 de largo total. Estos resultados demuestran por primera que el extremo C-terminal no es necesario para que Bcl-2 se asocie a la MME, pero si es un determinante molecular importante para la modulacion de la permeabilidad de la membrana mitocondrial