Caracterización estructural del gen AST de xanthophyllomyces dendrorhous (ex. phaffia rhodozyma)

Abstract

Los carotenoides son un grupo de pigmentos sintetizados de novo por diferentes organismos, tales como: Algas, algunas plantas, hongos y bacterias. Sin embargo, el resto de los animales son incapaces de producirlos y deben adquiridos a través de la dieta. Estos compuestos son importantes por su función biológica, como también por su directa aplicación industrial. Dentro de los carotenoides encontramos a la astaxantina que es reconocida por sus propiedades antioxidantes (Nakato, T y cols., 1999) y su utilización como pigmento en la industria de la acuicultura para la coloración de salmónidos (Gary and Setsuko, 1994). Actualmente, la industria salmonicultura utiliza un pigmento sintetizado químicamente, el cual es importado y corresponde a uno de los aditivos más caros en los costos de producción. Es por esto, que una de las alterativas más promisorias para la obtención de astaxantina natural, es la utilización de la levadura Xanthophyllomyces dendrorhous (ex. Phaffia rhodoaymd), que tiene la capacidad de producir hasta un 85 - 90 % de astaxantina. Si bien, este microorganismo sintetiza el pigmento, las cantidades normales son bajas (200 y 400 ng de astaxantina/g de peso seco) para ser utilizadas como fuente industrial, sin embargo, mediante mutagénesis clásica se ha logrado desarrollar capas sobre productoras, pero tienen la desventaja de ser cepas genéticamente inestables. En general, la mayoría de los estudios en esta especie están dirigidos especialmente al conocimiento de la carotenogénesis (An G. H y cols., 1989) y a la identificación de los genes que codifican para las diferentes enzimas de la ruta metabólica de astaxantina. En este trabajo, se caracterizó el gen ast que codifica para la enzima astaxantina sintasa, la cual cataliza la formación de astaxantina a partir de B- caroteno. Para ello, se elaboró una estrategia de clonación del gen ast, la cual consistió inicialmente en la construcción mediante hibridación, de un mapa de restricci6n

genómico de la cepa silvestre UCD 67-385 de X. dendrorhouss. El análisis de restriccion pemiti6 ubicar el gen en un fragmento Pstl de aproximadamente 4,0 kb, lo que permitió la construcción de una genoteca parcial en el sitio PstJ del vector pBluescript SK- y la selección de clones portadores de este gen mediante PCR. Paralelamente, se clone el CDNA de este gen a partir del RNA, mediante RT-PCR. Ambas versiones CDNA y gen6mico del gen ast fueron secuenciadas completamente y su análisis permitió determinar que la versión genómica posee un tamaño de 3,995 kb y esta constituida por 18 exones y 17 intrones, de diferentes longitudes. El análisis bioinformático de la secuencia nucleotídica del gen, indico un alto grado de similitud con enzimas del tipo citocromo P450 hidroxilasa, sugiriendo que se tota de un gen diferente al observado en otros organismos productores de astaxantina. Posteriormente, con el objetivo de determinar la localizaci6n del gen as/ en el genoma de la levadura, los cromosomas fueron separados mediante electroforesis de campo pulsado, determinándose mediante hibridaci6n que este gen se encontraría en 2 bandas cromosómicas. Finalmente, se realizó una deleción de gran parte del gen ast, se inserto un casete de resistencia al antibiótico higromicina B como método de selección y se transfomo X dendrorhous por integracion y reemplazo del gen ast, obtenidose colonias transformantes resistentes al antibiotico y de fenotipo amarillo. El análisis por HPLC de los pigmentos producidos por estos transformantes, indic6 que no producen astaxantina, acumulando solo P-caroteno, lo que demostraria la funcionalidad del gen