Sparc induce transición epitelio - mesénquima aumentando las propiedades invasivas y migratorias del cáncer de próstata a través de integrina AVB3 y ZEB

Abstract

Introducción La proteína ácida secretada y rica en cisteína (SPARC) es una proteína matricelular altamente expresada en el tejido óseo que actúa como un factor quimioatrayente que promueve la llegada de células de cáncer de próstata (CaP) a la médula ósea, dependiendo para esto de la expresión y actividad de integrina v3. Además, SPARC regula numerosos procesos biológicos claves para la progresión tumoral, como la proliferación celular, diferenciación, adhesión celular, mi-gración y angiogénesis. Sin embargo, en diversos modelos tumorales se ha visto que puede pro-mover como también inhibir estos procesos, dependiendo del contexto tumoral. Por lo tanto, la contribución de SPARC durante las primeras etapas de la progresión del CaP aún no está del claro. Recientemente se ha visto que SPARC aumenta la expresión de los factores de transcrip-ción Snail y Slug, que controlan la transición epitelio-mesénquima, junto con ZEB1 y otros factores de transcripción. En base a estos antecedentes, proponemos que SPARC induce transi-ción epitelio-mesénquima (TEM), a través de la vía de integrina v3, incrementando las capa-cidades migratorias e invasivas de las células de CaP. Materiales y métodos Evaluamos la expresión de SPARC en tumores primarios, cultivos primarios y líneas celulares de CaP. Para evaluar los efectos de SPARC en las células de CaP desarrollamos un modelo in vitro de silenciamiento y sobreexpresión de SPARC en líneas PC3 y LNCaP, respectivamente. En estas líneas evaluamos la expresión de marcadores de TEM, factores de transcripción Snail, Slug y ZEB1, diversas subunidades de integrinas y también de proteínas relacionadas con la vía 4 de señalización de integrinas: RAC1, RHOA, ILK y FAK. Además analizamos las capacidades funcionales de estas células en ensayos de migración, invasión, proliferación y formación de adhesiones focales. Para analizar la contribución de ZEB1 y de integrina v3 como mediadores de los efectos de SPARC, utilizamos células LNCaP con silenciamiento de ZEB1 y péptidos RGD selectivos para integrina v3. Resultados En nuestro modelo de CaP, SPARC induce TEM, disminuyendo la expresión de E-cadherina y citoqueratina 18 y aumentando la expresión de N-cadherina y vimentina. Además, SPARC in-duce la expresión de los factores de transcripción reguladores de TEM Snail, Slug y ZEB1. Funcionalmente, el silenciamiento de SPARC en las células PC3 disminuye la migración y la invasión in vitro, sin modificar la proliferación celular. Además, el silenciamiento de SPARC disminuye la expresión de la subunidad de integrina 3, y de alguno de sus efectores como RHOA, RAC1, ILK y P-FAK925, alterando la formación de adhesiones focales. El bloqueo específico de integrina v3 revierte la disminución de E-cadherina y aumento de vimentina, inducidos por SPARC. Por último, mostramos que la disminución de E-cadherina y el aumento de la migración, inducidos por SPARC, requieren de la activación de integrina v3 y de la expresión de ZEB1. Conclusión Nuestros resultados indican que SPARC se expresa en tumores de alto grado histológico SPARC, a través de integrina v3 y ZEB1 induce TEM, y mediante este programa, podría facilitar la progresión tumoral.

Introduction The secreted and cysteine-rich acidic protein (SPARC) is a matricellular protein highly ex-pressed in bone tissue that acts as a chemoattractant factor that promotes the arrival of prostate cancer cells (PCa) to the bone marrow, depending on the expression and activity of integrin v3. In addition, SPARC regulates numerous biological processes key for tumor progression, such as cell proliferation, differentiation, cell adhesion, migration and angiogenesis. However, in various tumor models it has been described that SPARC can promote, as well as inhibit, these processes, depending on the tumor context. Therefore, the contribution of SPARC during the early stages of the progression of PCa is not clear yet. Recently, it has been found that SPARC increases the expression of the Snail and Slug transcription factors, which control the epithelial-mesenchymal transition, along with ZEB1 and other transcription factors. Based on this back-ground, we propose that SPARC induces epithelial-mesenchymal transition (EMT), through an integrin v3 pathway, increasing the migratory and invasive capacities of PCa cells. Materials and methods We evaluated the expression of SPARC in primary tumors, primary cultures and PCa cell lines. To evaluate the effects of SPARC on PCa, we developed an in vitro model of silencing and overexpression of SPARC on PC3 and LNCaP cell lines, respectively. In this model, we evalu-ated the expression of EMT markers, Snail, Slug and ZEB1 transcription factors, various subu-nits of integrins and also of proteins related to the integrin signaling pathway: RAC1, RHOA, ILK and FAK. In addition, we analyzed the functional capacities of these cells in migration, 6 invasion, proliferation and focal adhesion formation assays. To analyze the contribution of ZEB1 and integrin v3 as mediators of the effects of SPARC, we used ZEB1 knocked down-LNCaP cells and RGD peptides that selectively target integrin v3. Results In our PCa model, SPARC induces EMT, decreasing the expression of E-cadherin and cy-tokeratin 18 and increasing the expression of N-cadherin and vimentin. In addition, SPARC induces the expression of the EMT regulatory transcription factors Snail, Slug and ZEB1. Func-tionally, knocking down SPARC in PC3 cells decreases migration and invasion in vitro, without modifying cell proliferation. In addition, SPARC silencing decreases the expression of the in-tegrin 3 subunit, and of some of its downstream effectors such as RHOA, RAC1, ILK and P-FAK925, altering the formation of focal adhesions. The specific blockade of integrin v3 re-verses the decrease in E-cadherin and increase in vimentin, induced by SPARC. Finally, we show that the decrease in E-cadherin and the increase in migration, induced by SPARC, require the activation of integrin v3 and the expression of ZEB1. Conclusion Our results indicate that SPARC is expressed in tumors of high histological grade. SPARC, through integrin v3 and ZEB1, induces EMT and through this program, it could facilitate tu-mor progression.