Estrategia Biotecnológica para la identificación y selección de genes que codifican para reguladores negativos de estrés salino e hídrico en Kiwi, variedad Hayward (Actinidia deliciosa)

Abstract

Los efectos del cambio climático, que incluyen variaciones significativas e irreversibles en la temperatura, están impactando la tierra y a la producción agrícola. La salinidad y sequía de suelos son los estreses abióticos que mas daño han causado al crecimiento y la producción de alimento. En este contexto, las tecnologías de edición genética, como CRISPR/Cas9, junto con el estudio de genomas, adquieren un papel fundamental para generar variedades de cultivos de importancia para el consumo humano que sean tolerantes al estrés hídrico y salino. Entre ellos destaca Actinidia deliciosa (kiwi), una fruta de gran importancia en Chile debido a su valor nutricional y su contribución al desarrollo agrícola del país. Por ello, se podrían generar plantas de kiwi tolerantes a estrés abiótico usando CRISPR. En esta tesis identificamos y seleccionamos tres genes candidatos a ser editados que codificarían para ubiquitinas ligasas (AdSRFP1, AdSAP7 y AdSARP1) y un gen que codificaría para una enzima de síntesis etileno (AdACS6,) ya que pueden actuar como reguladores negativos (RN) en la respuesta al estrés en kiwi Hayward y que pueden ser blanco de edición. Se determinó que los niveles de expresión de estos genes en plantas de Actinidia deliciosa var. Hayward aumentan en respuesta al estrés por sequía y salinidad. Además, se clonó el gen AdSAP7 ya que presentaba los mayores niveles de expresión y se generó un vector para su expresión en plantas. Se determinó que AdSAP7: GFP posee localización citoplasmática y nuclear, concordante con la función ubiquitin ligasa a la que codificaría. Se finalizó la tesis con la obtención de plantas de tabaco transformantes para SAP7 que serán usadas para futuros ensayos funcionales y finalizar la caracterización del gen. Para esto se propone un futuro ensayo crónico con las plantas transgénicas aclimatadas en tierra. Los resultados de este estudio permiten concluir que la estrategia empleada posibilita la identificación y selección de genes RN como potenciales candidatos a edición génica. Esto, a su vez, abre nuevas perspectivas para mejorar la tolerancia al estrés en cultivos agrícolas y proporciona un mayor entendimiento sobre los mecanismos de adaptación de las plantas a condiciones ambientales adversas.

The effects of climate change, which encompass significant and irreversible temperature variations, are impacting the land and agricultural production. Soil salinity and drought are the abiotic stresses that have caused the most damage to growth and food production. In this context, genetic editing technologies such as CRISPR/Cas9, coupled with genome studies, play a fundamental role in enabling the generation of crop varieties crucial for human consumption that are stress-tolerant, particularly to water and salinity stress. Among these, Actinidia deliciosa (kiwifruit), a fruit of great economic significance in Chile due to its nutritional value and contribution to the country's agricultural development, stands out. Thus, it is conceivable to engineer kiwifruit plants tolerant to abiotic stress using CRISPR. In this thesis, we identified and selected four candidate genes for editing that encode for ubiquitin ligases (AdSRFP1, AdSAP7, and AdSARP1) and the ethylene synthesis enzyme AdACS6. These genes were chosen as potential targets due to their role as negative regulators in the stress response of Hayward kiwifruit, and their potential suitability for editing. It was determined that the expression levels of these genes in Actinidia deliciosa var. Hayward plants increased in response to drought and salinity stress. Additionally, the AdSAP7 gene was cloned due to its higher expression levels, and a vector for its expression in plants was generated. It was found that AdSAP7: GFP had cytoplasmic and nuclear localization, consistent with its predicted function as a ubiquitin ligase. The thesis concluded with the successful generation of transformed tobacco plants for SAP7, which will be used for future functional assays and to complete the gene characterization. A future chronic assay with acclimatized transgenic plants in soil is proposed for this purpose. The results of this study lead to the conclusion that the employed strategy enables the identification and selection of negative regulator genes as potential candidates for genetic editing.