Dictyostelium discoideum vegetative cells DNA extracellular traps induced by different stimuli: A comparative analysis

Abstract

Dictyostelium discoideum es una ameba social versátil que en su ciclo de vida exhibe tanto etapas multicelulares como unicelulares, según las condiciones ambientales. Entre otras características, ha sido ampliamente utilizada como organismo modelo para el estudio de diversos procesos celulares, incluidos aquellos asociados con la inmunidad innata. Recientemente, las células centinela (células S) de su fase babosa multicelular han demostrado la capacidad de realizar ETosis, un proceso observado inicialmente en neutrófilos. La ETosis implica la liberación de ADN, formando trampas extracelulares (ETs) utilizadas para retener y neutralizar patógenos. Estudios previos realizados por nuestro grupo de investigación mostraron que la ETosis también ocurre en células vegetativas de D. discoideum después de la estimulación con diversas cepas bacterianas, no obstante, se desconoce cuáles serían las señales moleculares que inducen la producción de ETs, la naturaleza específica del ADN liberado, y las proteínas asociadas. En este estudio, empleamos lipopolisacáridos (LPS) de Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) y Salmonella enterica (S. enterica) para caracterizar la liberación de ETs, estableciendo un modelo fundamental para estudiar este proceso en células vegetativas de D. discoideum. Utilizando imagenología de células vivas, observamos ETs en células individuales y poblaciones celulares, revelando similitudes estructurales y dinámicas con células del sistema inmune como neutrófilos de mamíferos. Además, mediante qPCR, identificamos un aumento significativo en la secreción de ADN mitocondrial después de la estimulación con LPS de ambas cepas bacterianas. Por otra parte, desarrollamos una estrategia basada en proteómica cuantitativa para evaluar la presencia y abundancia relativa de proteínas asociadas a ETs de células vegetativas de D. discoideum inducidas por LPS de K. pneumoniae. Los resultados evidenciaron un aumento en la cantidad de proteínas asociadas a ETs durante su inducción. Un análisis de expresión diferencial identificó numerosas proteínas con funciones desconocidas en comparación con las células no inducidas. Además, dos proteínas de la familia de deshidrogenasa/reductasa de cadena corta fueron enriquecidas tras la estimulación. Estos hallazgos no solo ofrecen conocimientos valiosos sobre los mecanismos de la ETosis en D. discoideum, sino que también lo posicionan como un modelo prometedor de célula inmune para estudiar la producción de ETs. Esta investigación sienta las bases para futuros estudios sobre las proteínas y las vías específicas involucradas en la ETosis de D. discoideum, brindando una perspectiva única sobre los mecanismos de defensa antimicrobiana y la inmunidad innata.

Dictyostelium discoideum is a versatile social amoeba that, in its life cycle, exhibits both multicellular and unicellular stages depending on environmental conditions. Among other characteristics, it has been widely utilized as a model organism for the study of various cellular processes, including those associated with innate immunity. Recently, sentinel cells (S cells) from the multicellular slug phase have demonstrated the ability to undergo ETosis, a process initially observed in neutrophils. ETosis involves the release of DNA, forming extracellular traps (ETs) used to entrap and neutralize pathogens. Previous studies conducted by our research group demonstrated that ETosis also occurs in vegetative cells of D. discoideum after stimulation with various bacterial strains. However, the molecular signals inducing ET production, the specific nature of released DNA, and the associated proteins remain unknown. In this study, we employed lipopolysaccharides (LPS) from Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) and Salmonella enterica (S. enterica) to characterize ET release, establishing a foundational model to investigate this process in vegetative cells of D. discoideum. We observed ETs at both single-cell and population levels, utilizing live cell imaging, revealing structural and dynamic similarities with immune system cells such as mammalian neutrophils. Furthermore, through qPCR, we identified a significant increase in mitochondrial DNA secretion after LPS stimulation of both bacteria strains. Additionally, we developed a strategy based on quantitative proteomics to assess the presence and relative abundance of proteins associated with ETs in vegetative cells of D. discoideum induced by K. pneumoniae LPS. The results demonstrated an increase in the quantity of proteins associated with ETs during their induction. Differential expression analysis identified numerous proteins with unknown functions compared to non-induced cells. Additionally, two proteins from the short-chain dehydrogenase/reductase family were enriched upon stimulation. These findings offer valuable insights into the intricate mechanisms of ETosis in D. discoideum and position it as a promising immune cell model for studying ETs production. This research lays the groundwork for future studies on the specific proteins and pathways involved in D. discoideum ETosis, offering a unique perspective on antimicrobial defense mechanisms and innate immunity.