Participación del canal iónico TRPC6 en la regulación de la actividad del factor transcripcional YAP mediante las dinámicas del citoesqueleto de actina

Abstract

La contractilidad celular es un mecanismo implicado en diversos procesos celu- lares como la cicatrización de heridas y la contracción arterial, entre otros. La actividad

de los canales iónicos se ha asociado con la regulación de la contractilidad, a través de la modulación de vías de señalización que regulan propiedades mecánicas y del

citoesqueleto de actina, como la proteína RhoA GTPasa. Diversos reportes han rela- cionado a/ canal catiónico no selectivo permeable a calcio TRPC6 en la reparación de

distintos tejidos e incluso en fibrosis. Así mismo, diversas mutaciones de ganancia de

función de TRPC6 están asociadas a enfermedades en las que se deterioran el citoes- queleto de actina, afectando la contractilidad celular. De esta manera, el estudio de los

mecanismos moleculares por los que se regula la actividad de TRPC6 puede aportar nuevas evidencias para el uso de este canal como posible blanco terapéutico. Aunque el canal TRPC6 se sugiere como un regulador de la dinámica del citoesqueleto de actina, los eventos celulares que se desencadenan tras la activación de este canal han sido poco explorados. La proteína RhoA GTPasa monomérica permite la formación de filamentos de actina y adhesiones focales, modulando así la contractilidad celular y

promoviendo la expresión de genes asociados a la contracción a través de la modula- ción del factor transcripcional YAP. Por lo tanto, la regulación de RhoA podría ser un

evento clave para controlar la contractilidad celular. Sumado a esto, empleando es- pectrometría de masa se identificó que el efector de RhoA, Rhotekin (RTKN) está aso- ciado al canal TRPC6, lo cual podría ser un novedoso regulador de la actividad de este

canal. Tomando en consideración estas evidencias la hipótesis de esta tesis señala que: “El canal TRPC6 interactúa con la proteína RTKN y aumenta la actividad de la proteína RhoA y las dinámicas de citoesqueleto de actina, induciendo la activación del factor transcripcional YAP y la contractilidad celular”. Para comprobar esta hipótesis, se emplearon diversas técnicas de biología celular y molecular con el objetivo general de determinar la participación del canal TRPC6 en la regulación de la actividad de YAP

dependiente de RhoA y el citoesqueleto de actina en la contractilidad celular y la repa- ración de heridas. Esta tesis contempla el desarrollo de 3 objetivos específicos:

1. Determinar la participación de TRPC6 en la activación de la proteína RhoA GTPasa y las dinámicas del citoesqueleto de actina:

9 Para determinar el efecto de TRPC6 sobre la activación de RhoA se usaron diversas herramientas de imágenes y bioquímica que permitieron monitorear en tiempo real la actividad de RhoA. En conjunto, los resultados obtenidos sugieren que el canal TRPC6 promueve la actividad de RhoA. Así mismo, la modulación de la expresión de TRPC6 regula la formación y disposición de los filamentos de actina y las adhesiones focales,

dos componentes celulares requeridos para la contracción de la célula. Los datos ob- tenidos sugieren que el canal TRPC6 regula la actividad de RhoA, alterando la diná- mica de los filamentos de actina y las adhesiones focales.

2. Determinar el papel de la regulación de TRPC6 sobre la contractilidad celular y el factor transcripcional YAP: Los ensayos de contractilidad en geles tridimensionales de colágeno mostraron que el

canal TRPC6 promueve la contracción de células HeLa. De la misma manera, la mo- dulación de la expresión del canal regula la migración celular. Estos datos serían con- sistentes con los efectos observados en el primer objetivo. Así mismo, la sobrexpresión

de TRPC6 aumenta la localización nuclear de YAP, lo cual podría indicar la regulación de este factor por parte del canal. Estos datos proponen a TRPC6 como un regulador de la contracción y la migración celular, sugiriendo un posible efecto sobre la expresión de genes dependientes de YAP 3. Caracterizar la interacción de TRPC6 con RTKN y su efecto funcional: Combinando diversas aproximaciones bioquímicas y bioinformáticas se confirmaron los datos obtenidos de espectrometría de masa. Específicamente, los datos muestran que RTKN interactúa a través de su dominio RBD con el canal TRPC6. Empleando el

uso de diversas sondas para monitorear los cambios en el calcio intracelular se ob- servó que RTKN disminuye la actividad de TRPC6. Los ensayos de biotinilación de

proteínas de superficie, así como mediciones de microscopía TIRF sugieren que RTKN

reduce la abundancia de TRPC6 en la membrana plasmática, aumentando la localiza- ción del canal en endosomas tempranos. Estos datos sugieren a RTKN como un nuevo

regulador de TRPC6. En conjunto, los datos obtenidos en este trabajo doctoral proporciona nuevas evidencias sobre el efecto del canal TRPC6 sobre la contractilidad y migración celular, a través de la regulación de RhoA, el citoesqueleto de actina y las adhesiones focales.

10 Sumado a esto, a través de distintas herramientas se identificó a la proteína RTKN como nuevo regulador del tráfico retrógrado de TRPC6, afectando la actividad de este canal. Estos hallazgos aportan nuevos datos que permiten posicionar al canal TRPC6

como un interesante blanco para regular procesos fisiológicos dependientes de la con- tracción celular, así como posibles terápias aplicadas a patologías en las cuales este

canal presente una ganancia de función.

Cellular contractility is involved in various cellular processes, such as wound healing

and arterial contraction. Ion channels' activity has been associated with regulating con- tractility through the modulation of signaling pathways that regulate mechanical prop- erties and the actin cytoskeleton, such as RhoA GTPase. Several reports have related

to the nonselective calcium-permeable cation channel TRPC6 in repairing different tis- sues and even fibrosis. Conversely, TRPC6 gain-of-function changes are associated

with diseases in which the actin cytoskeleton and cell contractility are impaired. Thus, studying the molecular mechanisms by which TRPC6 activity is regulated may provide

new evidence for using this channel as a therapeutic target. Although the TRPC6 chan- nel is suggested as a regulator of the dynamics of the actin cytoskeleton, the cellular

events triggered after this channel's activation remain unclear. The monomeric RhoA GTPase allows the formation of actin filaments and focal adhesions, thus modulating cell contractility and promoting the expression of genes associated with contraction through the modulation of the transcriptional factor YAP. Therefore, regulating RhoA could be a key event in controlling cell contractility. Also, we found that Rhotekin

(RTKN), a RhoA effector, is associated with the TRPC6 channel using mass spectrom- etry, which could be a novel regulator of the activity of this channel. Thus, the hypoth- esis of this thesis suggests that: "The TRPC6 channel interacts with the RTKN protein

and increases the activity of the RhoA protein and the dynamics of the actin cytoskele- ton, inducing the activation of the transcriptional factor YAP and cell contractility". This

thesis considers three specific aims: 1. To determine the participation of TRPC6 in activating the RhoA GTPase protein and the dynamics of the actin cytoskeleton: We used imaging and biochemical tools

to determine the effect of TRPC6 on RhoA activation, to monitor RhoA activity in real- time. The results obtained suggest that the TRPC6 channel promotes RhoA activity.

Conversely, the modulation of the expression of TRPC6 regulates the formation and arrangement of actin filaments and focal adhesions, two cellular components required for cell contraction. The data obtained suggest that the TRPC6 channel regulates the activity of RhoA, altering the dynamics of actin filaments and focal adhesions.

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2. Determine the role of TRPC6 regulation on cell contractility and the transcrip- tional factor YAP: Contractility assays in three-dimensional collagen gels showed that

the TRPC6 channel promotes HeLa cell contraction. Similarly, the modulation of TRPC6 channel expression regulates cell migration. These data would be consistent with the effects observed in the first objective. Likewise, the overexpression of TRPC6 increases the nuclear localization of YAP, which could indicate the regulation of this factor by the channel. These data propose TRPC6 as a regulator of cell contraction and migration, suggesting a possible effect on YAP-dependent gene expression. 3. Characterize the interaction of TRPC6 with RTKN and its functional effect: We confirmed the data obtained from mass spectrometry by combining several biochemical and bioinformatic approaches. Our data shows that RTKN interacts with the TRPC6 channel through its RBD domain. Also, we observed that RTKN decreases the activity

of TRPC6. Surface protein biotinylation assays suggest that RTKN reduces the abun- dance of TRPC6 at the plasma membrane. These data indicate that RTKN is a new

regulator of TRPC6. The data obtained provide new evidence on the effect of the TRPC6 channel on cell contractility and migration through the regulation of RhoA, the actin cytoskeleton, and focal adhesions. In addition, RTKN protein was identified as a new regulator of TRPC6 retrograde trafficking. These findings provide new data that allow us to position the TRPC6 channel as an interesting target to regulate physiological processes dependent on cell contraction, as well as possible therapies applied to pathologies in which this channel presents a gain of function.