"Papel de la proteina 1 de adhesion de la celula vascular (vcam-1) en la cardiomiopatía inducida por obesidad"

Abstract

Introducción: La cardiomiopatía inducida por obesidad es una condición clínica que presenta efectos perjudiciales sobre la función cardiaca. Sin embargo, los mecanismos moleculares asociados a su desarrollo permanecen no completamente estudiados. La proteína de adhesión de la célula vascular 1 (VCAM-1), es una molécula de adhesión canónicamente encontrada en el endotelio de vasos sanguíneos bajo contextos inflamatorios, donde la presencia de VCAM-1 en la membrana de células endoteliales permite la adhesión y transmigración de células inflamatorias a sitios de inflamación en los tejidos. Hasta la fecha, se desconoce la participación de VCAM-1 cardiaca asociada con fenotipos de cardiomiopatía inducida por obesidad. Objetivos: Investigar los cambios en la función, morfología y marcadores moleculares asociados a VCAM-1 en un modelo experimental de cardiomiopatía inducida por obesidad en animales wild type y knock-out cardiomiocito específicos para VCAM-1 (c-VCAM-1-KO), con su respectivo control F/F. Métodos: Animales macho wild type, F/F y c-VCAM-1-KO cepa C57BL/6N de 10 semanas de edad fueron utilizados y aprobados para experimentación por el protocolo de bioética 20387-CYQ-UCH. Estos animales se alimentaron por 25 semanas con una dieta alta en grasas (HFD) (60% Kcal grasas) o dieta control (10% Kcal grasas). Se realizaron análisis morfométricos: peso corporal y de órganos como tejido adiposo e hígado para determinar obesidad. Para el análisis del corazón se determinó el peso del corazón y parámetros histológicos como: área de sección transversal y perímetro con la tinción con wheat germ agglutinin (WGA) y fibrosis por la tinción Picro-Sirius Red. Se realizaron ecocardiografías en animales despiertos en Modo M para determinar función sistólica (fracción de eyección y de acortamiento) y animales anestesiados mediante Doppler y Doppler tisular para evaluar las relaciones E/A y E/E’. Para evaluar el estado metabólico se realizaron test de tolerancia glucosa, ELISA kit para insulinemia, índice HOMA-IR y niveles de pAKT Ser 473 por Inmuno-blot para determinar resistencia a la insulina bajo un pulso de insulina. Se realizó test de tolerancia al ejercicio para determinar el estatus cardiovascular frente a esfuerzo. Se realizaron experimentos de RT-qPCR y Inmuno-blot para determinar la expresión génica y proteica, respectivamente, de VCAM-1, ANP, BNP, -MHC y FoxO1, como también la medición de niveles plasmáticos de VCAM-1 soluble mediante ELISA. Resultados: Los animales wild type alimentados con HFD presentaron obesidad, intolerancia a la glucosa, hiperinsulinemia, resistencia a la insulina e hipertrofia cardiaca, como también aumento de los niveles génicos y solubles de VCAM-1, estableciendo un modelo de cardiomiopatía inducida por obesidad. Los

13 animales c-VCAM-1-KO alimentados con dieta alta en grasas presentaron obesidad e intolerancia a la glucosa, sin embargo, la hiperinsulinemia y sensibilidad a la insulina mediante el aumento en la pAKT (Ser 473) bajo un pulso de insulina no fueron concluyentes. Además, presentaron disfunción diastólica con un aumento de la razón E/E`, disfunción sistólica con una disminución de la fracción de eyección y acortamiento, hipertrofia cardiaca con aumento del peso del corazón, área de sección transversal de los cardiomiocitos y marcadores patológicos como ANP y BNP, fibrosis e intolerancia al ejercicio, mostrando un fenotipo de cardiomiopatía inducida por obesidad acentuado y patológico, con insuficiencia cardiaca con fracción de eyección reducida. Los niveles circulantes de sVCAM-1 en los animales F/F HFD están aumentados, no así la condición c-VCAM-1-KO alimentados con HFD. Conclusión: Los resultados muestran que los animales c-VCAM-1-KO alimentados con HFD exacerban el fenotipo hipertrófico inducido por la HFD, induciendo insuficiencia cardiaca con disfunción sistólica y diastólica, sugiriendo que los niveles de sVCAM-1 y VCAM-1 en el corazón serían una respuesta compensatoria al daño inducido por la HFD. Por lo tanto, VCAM-1 tendría un papel protector en el modelo de cardiomiopatía inducido por la dieta alta en grasas.

Introduction: Obesity-induced cardiomyopathy is a clinical condition that has detrimental effects on cardiac function. However, the molecular mechanisms associated with its development have not been fully studied. Vascular cell adhesion protein 1 (VCAM-1), is an adhesion molecule canonically found in the endothelium of blood vessels under inflammatory contexts, the presence of VCAM-1 in the endothelial cell membrane allows adhesion and transmigration of inflammatory cells to sites of inflammation in tissues. To date, the role of cardiac VCAM-1 associated with obesity-induced cardiomyopathy phenotypes is unknown.

Objectives: To investigate the changes in the function, morphology, and molecular markers associated with VCAM-1 in an experimental model of cardiomyopathy induced by obesity in wild-type and cardiomyocyte knockout animals specific for VCAM-1 (c-VCAM-1-KO) with its respective F/F control.

Methods: Male wild type, F/F and c-VCAM-1-KO strain C57BL/6N animals of 10 weeks of age were used and approved for experimentation by bioethics protocol 20387-CYQ-UCH. These animals were fed for 25 weeks with a high-fat diet (HFD) (60% Kcal fat) or a control diet (10% Kcal fat). Morphometric analyzes were performed: body weight and organs such as adipose tissue and liver to determine obesity. For heart analysis, heart weight and histological parameters such as: cross-sectional area and perimeter were determined by wheat germ agglutinin (WGA) staining and fibrosis by Picro-Sirius Red staining. Echocardiography was performed in awake animals in M-Mode to determine the systolic function (ejection fraction and shortening); and in anesthetized animals using Doppler and tissue Doppler to evaluate the E/A and E/E' ratios. To evaluate the metabolic state, the glucose tolerance test, ELISA kit for insulinemia, determination of HOMA-IR index, and pAKT Ser 473 levels by Immuno-blot were performed to determine insulin resistance under an insulin pulse. An exercise tolerance test was performed to determine cardiovascular status against exertion. RT-qPCR and Immuno-blot experiments

were performed to determine gene and protein expression, respectively, of VCAM-1, ANP, BNP, β- MHC, and FoxO1, as well as the measurement of soluble plasma VCAM-1 levels by ELISA.

Results: Wild-type animals fed with HFD presented obesity, glucose intolerance, hyperinsulinemia, insulin resistance and cardiac hypertrophy, as well an increase in soluble and gene levels of VCAM-1, providing a model of obesity-induced cardiomyopathy. c-VCAM-1-KO animals fed high-fat diet obesity

15 and glucose intolerance, however hyperinsulinemia and insulin sensitivity by an increase in pAKT (Ser 473) under pulse insulin were inconclusive. Additionally, diastolic dysfunction with increased E/E` ratio, systolic dysfunction with decreased ejection fraction and shortening, cardiac hypertrophy with increased heart weight, cardiomyocyte cross-sectional area, and pathologic markers such as ANP and BNP, fibrosis, and exercise intolerance, showing a phenotype of marked and pathological obesity-induced cardiomyopathy, with heart failure with reduced ejection fraction. Circulating levels of sVCAM in F/F HFD animals are increased, but not in condition c-VCAM-1-KO HFD.

Conclusion: The results show that c-VCAM-1-KO animals fed with HFD exacerbate the hypertrophic phenotype induced by HFD, inducing heart failure with systolic and diastolic dysfunction, suggesting that the levels of sVCAM-1 and VCAM-1 in the heart would be a compensatory response to the damage induced by HFD. Therefore, VCAM-1 has a protective role in a model of high-fat diet-induced cardiomyopathy.