"Rol de hsa-mir-424-5p y hsa-mir-513c-3p en la regulación de los niveles de transcrito de atf6α y xbp1s en respuesta a ifnγ en el síndrome de Sjögren"

Abstract

El síndrome de Sjögren (SS) es una enfermedad autoinmune, inflamatoria y crónica que afecta principalmente a las glándulas salivales (GS) y lagrimales. Las GS de pacientes SS presentan estrés de retículo endoplásmico (RE) crónico y una alteración en la activación de las vías de respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), evidenciado por un aumento de la vía ATF6α y una atenuación de componentes de la vía IRE1α. Además, las GS presentan altos niveles de citoquinas pro-inflamatorias, como IFNγ que ha mostrado ser inductor de estrés de RE. Estudios previos han mostrado que la estimulación con IFNγ induce cambios en la metilación del DNA de los promotores de ATF6α y XBP1s. Interesantemente, la metilación del DNA puede actuar en conjunto con otros mecanismos de regulación de la expresión génica, como los miRNAs. En GS de pacientes SS se reportó una disminución de hsa-miR-424-5p y un aumento de hsa-miR-513c-3p mediante un microarreglo, los cuales por análisis in silico surgirían como candidatos que regularían los niveles de ATF6α y XBP1s, respectivamente. Se ha reportado que las citoquinas como IFNγ regulan la expresión de miRNAs, aunque los mecanismos moleculares no están completamente descritos. A la fecha, no existen estudios reportados que relacionen miRNAs y UPR en el SS y se desconoce el efecto de IFNγ sobre los niveles de hsa-miR-424-5p y hsa-miR-513c-3p, por lo tanto, es interesante preguntarse si ¿El IFNγ promueve cambios en la expresión de hsa-miR-424-5p y hsa-miR-513c-3p, que den cuenta de los cambios en los niveles de transcrito de ATF6α y XBP1s en GS de pacientes SS? Para abordar esta pregunta se planteó la siguiente hipótesis: hsa-miR-424-5p y hsa-miR-513c-3p regulan los niveles de transcrito de ATF6α y XBP1s en respuesta a IFNγ en GS de pacientes SS. Como objetivo general se propuso evaluar el efecto de IFNγ sobre la expresión de hsa-miR-424-5p y hsa-miR-513c-3p y cómo éstos regulan los niveles de transcrito de ATF6α y XBP1s, en GS de pacientes SS y en cultivo de acinos en 3 dimensiones (3D). Para probar esta hipótesis, en esta tesis se realizó una secuenciación masiva de sRNAs donde se evaluaron los miRNAs diferencialmente expresados en GS. Además, se determinó los niveles de hsa-miR-424-5p y sus blancos directos ATF6 y SEL1L e indirecto HERP y los niveles de hsa-miR-513c-3p y sus blancos predichos XBP1s y GRP78 en GS de pacientes SS e individuos controles y en el modelo de acinos 3D estimulados por IFNγ. Se realizaron ensayos funcionales y de interacción para determinar si los miRNAs hsa-miR-424-5p y hsa-miR-513c-3p regulan directamente a sus blancos. Los resultados mostraron miRNAs diferencialmente expresados entre pacientes SS e individuos controles que se asociaron con moléculas desreguladas en el SS. Los niveles de hsa-miR-424-5p y hsa-

10 miR-513c-3p correlacionaron negativamente con los niveles de transcrito y proteicos de ATF6, SEL1L y XBP1s, GRP78, respectivamente en GS de pacientes SS en relación a individuos controles. Más aun, IFNγ indujo cambios en los niveles de hsa-miR-424-5p y hsa-miR-513c-3p y, en consecuencia, estos cambios promovieron un efecto en los niveles de transcrito y proteicos de ATF6, SEL1L y XBP1s, GRP78, respectivamente en acinos 3D. Por último, los ensayos funcionales y de interacción revelaron que hsa-miR-424-5p tiene como blanco directo al mRNA de ATF6 y a su vez hsa-miR-513c-3p tiene como blanco directo al mRNA de XBP1s. Los mecanismos por los cuales IFNγ promueve cambios en los niveles de hsa-miR-424-5p y hsa-miR-513c-3p aún deben ser dilucidados. Sobre este punto, es posible

hipotetizar que IFNγ promueva el reclutamiento de un complejo represor en el promotor hsa-miR- 424-5p lo que disminuiría su transcripción o promueva cambios en NEAT1, un lncRNA que actúa como

esponja de hsa-miR-424-5p y que consecuentemente aumente los niveles de transcrito y proteicos de ATF6 y SEL1L en GS de pacientes SS. A su vez, IFNγ promovería la activación de la vía JAK/STAT, lo que conlleva a la activación de STAT1 e IRF1 en el promotor de hsa-miR-513c-3p, lo que potencialmente conduce a una disminución de los niveles de transcrito y proteicos de XBP1s y GRP78 en GS de pacientes SS. Estos resultados, junto con los hallazgos previos, demuestran una nueva visión integrada que sugiere que algunos genes están regulados por la acción combinada de los miRNAs y la metilación del DNA. La modulación de estos mecanismos de regulación de expresión génica por IFNγ puede explicar la expresión alterada de factores de transcripción claves implicados en la proteostasis celular que controlan la función secretora en GS de pacientes SS. Estos hallazgos, nos permiten postular posibles mecanismos moleculares por los cuales la UPR está desregulada en el SS y contribuir a comprender las causas de la hipofunción glandular en este síndrome.

Sjögren's syndrome (SS) is an autoimmune, inflammatory, and chronic disease that mainly affects salivary glands (SG) and lacrimal glands. SGs from SS patients show chronic endoplasmic reticulum (ER) stress and altered activation of the unfolded protein response (UPR) pathway, evidenced by increased ATF6α pathway activity and attenuation of the IRE1α pathway. Furthermore, SGs exhibit high levels of pro-inflammatory cytokines, such as IFNγ, known to be inducers of ER stress. Previous studies have shown that IFNγ stimulation induces changes in DNA methylation of ATF6α and XBP1s promoters. Interestingly, DNA methylation can interact simultaneously with other mechanisms, such as miRNAs that regulate gene expression. A microarray found miRNAs hsa-miR-424-5p downregulated and hsa-miR-513c-3p overexpressed in SGs from SS patients. Using in silico analysis, these miRNAs emerged as candidates that would regulate ATF6α and XBP1s levels, respectively. Cytokines such as IFNγ regulate the expression of miRNAs, although the molecular mechanisms are not completely described. To date, there are no reported studies that link miRNAs with the UPR in SS, and the effect of IFNγ on hsa-miR-424-5p and hsa-miR-513c-3p is unknown. Therefore, it would be interesting to investigate if IFNγ would promote changes on hsa-miR-424-5p and hsa-miR-513c-3p expression accounting for the changes in transcript levels of ATF6α and XBP1s in SGs of patients with SS? To address this question, we proposed the following hypothesis: hsa-miR-424-5p and hsa-miR-513c-3p regulate ATF6α and XBP1s transcript levels in response to IFNγ in SGs from SS patients. As our general

objective, we proposed to evaluate the effect of IFNγ on the expression of hsa-miR-424-5p and hsa- miR-513c-3p and how they regulate the transcript levels of ATF6α and XBP1s in SG of SS patients and

in 3D acini cultures. To address this hypothesis, we carried out massive sequencing of sRNAs to evaluate the differentially expressed miRNAs. In addition, hsa-miR-424-5p and its direct targets ATF6 and SEL1L and indirect target HERP, hsa-miR-513c-3p levels, and predicted targets XBP1s and GRP78 were determined in the SGs of SS patients and control individuals and in the model of 3D acini stimulated with IFNγ. We performed functional and interaction assays to determine if hsa-miR-424-5p and hsa-miR-513c-3p directly regulate their targets. The results showed differentially expressed miRNAs between SS patients and control individuals that were associated with deregulated molecules in SS. Furthermore, we determined that the levels of hsa-miR-424-5p and hsa-miR-513c-3p correlated negatively with the transcript and protein levels of ATF6, SEL1L, and XBP1s, GRP78, respectively in SGs of SS patients compared to controls. IFNγ induced changes in the levels of hsa-miR-424-5p and hsa-

12 miR-513c-3p and, consequently, these changes affected transcript and protein levels of ATF6, SEL1L and XBP1s, GRP78, respectively in 3D acini. Finally, functional and interaction assays revealed that hsa-miR-424-5p targets ATF6 directly and hsa-miR-513c-3p targets XBP1s directly. The mechanisms by which IFNγ changes hsa-miR-424-5p and hsa-miR-513c-3p levels have not yet to be elucidated. It is likely that IFNγ promotes the recruitment of a repressor complex in the hsa-miR-424-5p promoter, which would decrease its transcription or promote changes in NEAT1, a lncRNA that acts as a sponge for hsa-miR-424-5p and consequently increase the transcript and protein levels of ATF6 and SEL1L in the SGs of SS patients. In turn, IFNγ would promote the activation of the JAK/STAT pathway, which activates STAT1 and IRF1 in the hsa-miR-513c-3p promoter, potentially leading to a decrease in transcript and protein levels of XBP1s and GRP78 in SGs of SS patients. These results, along with previous findings, demonstrate the new integrated view that some genes are regulated by the combined action of miRNAs and DNA methylation. Modulation of these mechanisms by IFNγ may explain the altered expression of key transcription factors involved in cellular proteostasis that control secretory function in the SGs of SS patients. These findings allow us to propose possible molecular mechanisms by which the UPR is dysregulated in SS and contribute to understanding the causes of glandular hypofunction in this syndrome.