Analysis and modeling of microtubule array self-organization

Abstract

La orientación del plano de división celular guía la morfogénesis de tejidos en animales y plantas. Particularmente en animales, los problemas en la orientación del plano de división son la causa de enfermedades como el cáncer de colon y la microcefalia primaria autosómica recesiva; mientras que en células de plantas, las divisiones celulares orientadas incorrectamente afectan la formación y organización de los tejidos. Se han propuesto reglas homólogas de división celular para ambos tipos de células. Estas reglas consideran las propiedades geométricas de cada célula y señalan que en divisiones simétricas, el plano de división se posiciona minimizando el área y generando dos células hijas de igual volumen. Sin embargo, a diferencia de las células animales, las células de plantas, tienen una forma definida debido a la pared celular que las rodea, por lo que resulta un modelo apropiado para comprender la relación entre la forma y el posicionamiento del plano de división. Específicamente en plantas, el mecanismo celular detrás de la localización del plano se basa en el ensamblaje de una estructura citoesquelética, la banda preprofásica o PPB, la cual está formada por microtubulos (MTs) corticales ubicados en el futuro sitio de división. En este respecto, existe una amplia evidencia de que la inestabilidad dinámica de los MTs y la interacción MT-MT contribuye a la formación de la PPB. Además, la organización de los MTs es afectada por el borde de la célula y por lo tanto por la geometría celular. Sin embargo, todavía no está claro cómo estos factores conducen a la formación y localización de la PPB. En esta tesis, nosotros confirmamos la hipótesis que la dinámica de los MTs

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y la interacción de los MTs con el borde de las célula son suficientes para explicar el posicionamiento de la PPB en configuraciones que minimIzan su área. La hipótesis fue validada usando dos líneas transgénicas del modelo biológico Marchantia polymorpha, Lit6b-mCitrin y tub1-GFP. Para probar la regla de división celular, seguimos la formación del plano de división a través de microscopía confocal. En éstas imágenes medimos la proporción de células que se dividen a lo largo de los planos de división más cortos predichos por la regla de división geométrica. Este análisis mostró que el 80% de las células se dividen a lo largo del plano de división más corto, con una proporción decreciente de células que se dividen en los otros planos. Con esto, fue validada la regla de división celular geométrica en Marchantia polymorpha. Luego, para estudiar la relación de la forma celular con la organización de los MTs en interfase, analizamos la orientación global de los MTs. Así, observamos que el 50% de las células dirigen los MTs siguiendo la orientación del plano más corto predicho por la regla de división celular. Por lo tanto, los MTs responden a la forma de la célula para organizar la red microtubular. En el momento en que se finaliza la interfase (preprofase) y se gatilla la división celular, la red microtubular se auto-organiza para formar la PPB. Para estudiar este proceso realizamos un seguimiento de la PPB, para lo cual adquirimos imágenes con una alta resolución temporal y espacial de la distribución de MTs. Usando métodos cuantitativos, confirmamos que los MTs se alinean a lo largo de los planos de división predichos por la regla geométrica. Adicionalmente, encontramos que los MTs se orientan de forma ortogonal cercanos al borde de la célula. Esta característica se

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incluyó en el modelo biofísico propuesto. Posteriormente, desarrollamos el modelo biofísico con el fin de explicar la regla empírica de división. Para esto, simulamos la inestabilidad dinámica de los MTs, la interacción MT-MT y la interacción de los MTs con el borde de la célula. Al imponer un tiempo de pausa en el borde de la célula, obtuvimos una correlación entre la orientación microtubular predicha por el modelo y los patrones de MTs observados experimentalmente. De esta forma, logramos generar una estructura similar a la PPB. En resumen, en esta tesis doctoral encontramos que las propiedades dinámicas de los MTs y el tiempo de pausa en el borde celular son suficientes para explicar la formación de la PPB en una configuración que minimiza su área. Estos resultados proporcionan la base para comprender el mecanismo dinámico detrás del establecimiento del plano de división en células de planta y podría, por analogía, contribuir a un mejor entendimiento de las enfermedades causadas por el mal posicionamiento del plano de división en células animales.

The orientation of cell division guides the morphogenesis of tissues in animals and plants. In animals, the mis-orientation of cell division is the cause of diseases such as colon cancer and autosomal recessive primary microcephaly. In plant cells, orientated cell divisions affect tissue formation and organization. In both animals and plants, homologous cell division rules have been proposed, which consider the geometric properties of the cell and postulate that in symmetric divisions, the division plane is positioned such that its area is minimized while producing two daughter cells of equal volume. Interestingly, plant cells have a defined shape due to the cell wall that surrounds them, so it is natural to expect a relationship between shape and the positioning of the division plane. In plants, the cellular mechanism behind the localization of the division plane relies on the assembly of a cytoskeletal structure, the preprophase band or PPB, which is formed by cortical microtubules (MTs) at the future division site. There is extensive evidence that the dynamic instability of MTs and their mutual interactions contribute to the formation of the PPB. In addition, it has been shown that the organization of MTs is affected by the border of the cell and therefore by the cell geometry. However, it is not yet clear how these processes lead to the formation and localization of PPB. In this thesis, we tested the hypothesis that microtubule dynamics and the interaction of MTs with the cell edges are sufficient to explain the positioning of the PPB in least-area configurations. Our hypothesis was validated using two transgenic lines of the biological model Marchantia polymorpha, Lit6b-mCitrin and

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tub1-GFP. To test the cell division rule in our system, we tracked the formation of new division planes. We measured the proportion of cells that divide along the shortest alternative division planes predicted by the rule. This analysis showed that 80% of the cells divide along the shortest division plane, with a decreasing proportion of cells dividing in the other planes. Hence, we validated the geometrical cell division rule in Marchantia polymorpha. To study MT organization in interphase in relation to cell shape, we analyzed the global MT orientation. We found that 50% of the cells orient their MTs according to the shortest plane predicted by the cell division rule. Therefore, MTs are able to sense cell shape to organize into MT arrays. When cell division is triggered, MTs self-organize to form the PPB. We followed this process acquiring time-lapses with a high temporal and spatial resolution of MT distribution. Using quantitative image analysis, we confirm that MTs are able to align along the alternative division planes predicted by the division rule. We also found that MTs were typically oriented orthogonal to the closest cell edge. This feature was later included in our biophysical model of MT self-organization. A biophysical model, developed in C++, was used to simulate the dynamic instability of MTs and the MT-MT interactions within the confine of the cell geometry in order to explain the empirical cell division rule. By imposing a pause time in the cell edges, we obtained a correlation between the MT orientation predicted by the model and the experimentally observed MT patterns. Interestingly, a PPB-lie structure was formed

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when the tri-dimensional cell shape was considered. In summary, in this PhD thesis we found that the dynamic properties of MTs and the pause time at the cell border are enough to explain the assembly of the PPB in least-area configuration. These results provided a basis to understand the molecular mechanism behind the selection of a division plane in plant cells and could, by analogy, contribute to a better understanding of diseases caused by mis-positioning of the division plane in animal cells.