Mecanismo de activación del promotor lítico Zp de virus Epstein-Barr por componentes del humo de cigarrillo en células epiteliales orales

Abstract

El carcinoma oral de células escamosas (COCE) es el tipo más común de cáncer de cabeza y cuello y está fuertemente asociado al hábito tabáquico (HT). Sin embargo, factores adicionales pueden estar involucrados. En particular, el virus Epstein-Barr (VEB) es un herpesvirus ubicuo, el cual es el agente causal de carcinoma nasofaríngeo y de un subgrupo de adenocarcinomas gástricos y linfomas. Además, el VEB ha sido detectado en COCE, aunque su rol es desconocido. Hay evidencia que la proteína viral Zebra es expresada en tumores epiteliales asociados a VEB. Zebra es la reguladora del switch latente-lítico, cuyos transcritos son expresados desde el promotor Zp. En esta tesis, se planteó la hipótesis: “Los componentes del condensado del humo del cigarrillo (CHC) activan el promotor Zp de VEB a través del reclutamiento de factores de transcripción (FT) expresados en células epiteliales orales”. El primer objetivo fue evaluar la activación del promotor viral Zp de VEB y de mutantes de deleción y sustitución por CHC en células epiteliales orales. Mediante ensayos de luciferasa usando el vector reportero dual pmir-GLO se encontró que Zp es activado después de la incubación de células orales CAL-27 y SCC-143 con 10 μg/mL y 50 μg/mL de CHC, respectivamente. Además, deleciones en las secuencias TTGCTA – TTGCAC/C reconocidas por la proteína c/EBP en los dominios ZIIIB y ZV ́, disminuyeron significativamente la actividad de Zp. La actividad de Zp también disminuyó al sustituir una C/G en la secuencia TTGCACG reconocida por la isoforma c/EBPα en el dominio ZV ́ del promotor Zp. El segundo objetivo fue determinar in sílico FT candidatos a ser reclutados en el promotor viral Zp en carcinomas asociados a la exposición a HC, incluyendo COCE y LUAD (adenocarcinoma pulmonar). La predicción determinó 23 FT cuyos niveles de transcritos no mostraron asociación con el HT en COCE. Sin embargo, se detectó asociación estadísticamente significativa entre los niveles de transcritos de c/EBPβ y el HT en pacientes con LUAD. El tercer objetivo fue evaluar el reclutamiento de FT candidatos en el promotor Zp en células epiteliales orales expuestas a CHC. El ensayo de ChIP determinó el reclutamiento de la proteína c/EBPβ en el dominio ZV ́ del promotor Zp en las células CAL-27. Los datos obtenidos en esta tesis permiten concluir que el CHC activa Zp en células orales y que la proteína c/EBPβ podría estar involucrada en el incremento en la actividad de Zp en presencia de CHC.

Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most common type of head and neck cancer, strongly associated with tobacco smoking (TS). However, additional factors may be involved. In particular, Epstein-Barr virus (EBV) is a ubiquitous herpesvirus, which is the etiologic agent of nasopharyngeal carcinoma, a subgroup of gastric adenocarcinomas and lymphomas. In addition, EBV has been detected in OSCCs, although its role in these tumors is still unknown. There is evidence that Zebra protein is expressed in EBV-associated tumors. Zebra is the regulator of the latent-lytic switch, whose transcripts are expressed from the Zp promoter. In this thesis, the following hypothesis was raised: “Cigarrete smoke components (CSC) activate the EBV Zp promoter through the recruitment of transcription factors (TF) expressed in oral epithelial cells”. The first objective was to evaluate the activation of the EBV Zp promoter and deletion and substitution mutants by CSC in oral epithelial cells. Through luciferase assays using the pmir-GLO dual reporter vector, it was found that Zp is activated after the incubation of CAL-27 and SCC-143 oral cells with 10 μg/mL and 50 μg/mL of CSC, respectively. In addition, deletions in the TTGCTA – TTGCAC/C sequences recognized by the cellular protein c/EBP in the domains ZIIIB and ZV ́, significantly decreased Zp activity. Zp activity was also decreased by substituting a C/G in the TTGCACG sequence recognized by the c/EBPα isoform in the ZV ́ domain of the Zp promoter. The second objective was to determine in sílico TF candidates to be recruited in the viral Zp promoter in carcinomas associated with TS exposure, including COCE and LUAD (lung adenocarcinoma). The prediction determined 23 cell TFs whose transcript levels did not show any association with TS in COCE. However, a statistically significant association was detected between the transcript levels of c/EBPβ and TS in patients with LUAD. The third objective was to evaluate the recruitment of candidate TFs at the Zp promoter in oral epithelial cells exposed to CSC. The ChIP assay determined the recruitment of c/EBPβ protein into the ZV ́ domain of the Zp promoter in CAL-27 cells. The data obtained in this thesis allow us to conclude that CSC activates Zp in oral cells and that the c/EBPβ protein may be involved in the increase in Zp activity in the presence of CSC.