Participación de los efectores GtgE y SopD2 de Salmonella Typhimurium en la inhibición del reclutamiento de Rab32A hacia la vacuola contenedora de Salmonella en Dictyostelium discoideum y su contribución a la supervivencia intracelular y virulencia bacteriana

Abstract

Salmonella is a genus of enteropathogenic bacteria grouping more than 2,600 serotypes, most of which infect warm-blooded animals. The interaction of Salmonella with its host is conditioned by multiple virulence factors, the most relevant during its infective cycle being two type III secretion systems (T3SSs) independently encoded in the pathogenicity islands SPI-1 (T3SS-1) and SPI-2 (T3SS-2). T3SSs translocate effector proteins directly to a eukaryotic cell to subvert its basic cellular processes. T3SS-1 and its effectors are essential for the invasion of Salmonella into host cells, where this bacterium survive and replicate intracellularly in a specialized membranous compartment, called the "Salmonella-containing vacuole" (SCV). To establish and maintain the SCV during infection, Salmonella subverts vesicular trafficking inside host cell by a series of effectors translocated primarily by T3SS-2. Many of these effectors target small GTPases of the Rab family, such as Rab32. Among other functions, the Rab32 protein is part of a pathway that contributes to restricting the intracellular growth of pathogenic bacteria such as Salmonella, Listeria and Mycobacterium. In the case of Salmonella, Rab32 is recruited to the SCV and commands the delivery of itaconate, a mitochondrial metabolite with antimicrobial activity. The GtgE (cysteine protease) and SopD2 (GTPase activating protein; GAP) effectors of Salmonella Typhimurium act cooperatively to proteolyze Rab32 and prevent its recruitment to the SCV, promoting the survival of the bacterium in macrophages, as well as its systemic colonization and virulence in mice. During its life cycle, Salmonella interacts with amoebae and other phagocytic protozoa in the environment. The ability of Salmonella to survive intracellularly in amoebae, including in the model amoeba Dictyostelium discoideum, has already been described, but without exploring in depth the molecular mechanisms and virulence factors involved. Our group has reported that S. Typhimurium requires T3SS-1 and T3SS-2 to survive within D. discoideum residing intracellularly in an SCV-like compartment, similar to that previously described in macrophages. In addition, D. discoideum shares with macrophages many of the phagosome-associated proteins, including Rab32. In fact, in this amoeba there are 4 proteins homologous to Rab32 (Rab32A-D), being Rab32A the only one identified in phagosomes and associated with the "Legionella-containing vacuole" (LCV). The aim of this work is to determine whether the effectors GtgE and SopD2 contribute to the intracellular survival and virulence of S. Typhimurium in D. discoideum by proteolysis of Rab32A protein and preventing its recruitment to the SCV. For this, ΔgtgE, ΔsopD2 and ΔgtgE ΔsopD2 mutants of S. Typhimurium were generated and their intracellular survival in D. discoideum was assessed by infection assays. In addition, the virulence of these mutants was assessed by social developmental assays in the amoeba. All mutants showed increased internalization and decreased intracellular survival compared to the wild-type strain. Also, the mutants were unable to retard amoeba social development, unlike the wild-type strain. The trans complementation of ΔgtgE and ΔsopD2 mutans restored wild-type levels of internalization, intracellular survival and the ability to delay the amoeba social cycle. In parallel, we identified by bioinformatic analysis that the four Rab32 proteins of D. discoideum share a high amino acid similarity with mammalian Rab32 proteins, even conserving the sequence motif recognized by GtgE. To assess the proteolytic activity of GtgE, a Rab32A-6xHis fusion was generated for its recombinant expression in an Escherichia coli strain that also expresses the wild-type GtgE effector or a variant without catalytic activity (GtgEH151A). Proteolysis of Rab32A-6xHis was observed when expression of wild-type GtgE and not the GtgEH151A variant was induced. Finally, a D. discoideum lineage expressing a GFP-Rab32A fusion was generated to monitor its subcellular localization by confocal microscopy in amoebae infected with the wild-type or a ΔgtgE ΔsopD2 mutant strain of S. Typhimurium. In the absence of infection, GFP-Rab32A accumulated around intracellular compartments of variable size. This distribution was not altered in amoebae infected with either the wildtype or the ΔgtgE ΔsopD2 mutant strain. Overall, the results obtained suggest that GtgE and SopD2 contribute to the intracellular survival and virulence of S. Typhimurium in D. discoideum and that all Rab32 proteins of the amoeba would be potential targets of GtgE, with Rab32A being effectively proteolyzed by the effector. On the other hand, Rab32A is associated with intracellular membranous compartments in D. discoideum, and this subcellular distribution that does not change during S. Typhimurium infection under the experimental conditions analyzed.

Salmonella es un género de bacterias enteropatógenas que agrupa más de 2.600 serotipos, los que en su mayoría infectan animales de sangre caliente. La interacción de Salmonella con su hospedero es condicionada por múltiples factores de virulencia, siendo los más relevantes durante su ciclo infectivo dos sistemas de secreción de tipo III (T3SSs) codificados independientemente en las islas de patogenicidad SPI-1 (T3SS-1) y SPI-2 (T3SS-2). Los T3SSs translocan proteínas efectoras directamente hacía una célula eucarionte para subvertir sus procesos celulares básicos. El T3SS-1 y sus efectores son esenciales para la invasión de Salmonella en células del hospedero, donde la bacteria sobrevive y se replica intracelularmente en un compartimiento membranoso especializado, llamado “vacuola contenedora de Salmonella” (SCV). Para establecer y mantener la SCV durante el proceso infectivo, Salmonella subvierte el tráfico vesicular de la célula hospedera mediante una serie de efectores translocados principalmente por el T3SS-2. Muchos de estos efectores están dirigidos contra GTPasas pequeñas de la familia Rab, como Rab32. Entre otras funciones, la proteína Rab32 es parte de una vía que contribuye a restringir el crecimiento intracelular de bacterias patógenas como Salmonella, Listeria y Mycobacterium. En el caso de Salmonella, Rab32 es reclutada hacia la SCV y comanda la entrega de itaconato, un metabolito mitocondrial con actividad antimicrobiana. Los efectores GtgE (cisteína proteasa) y SopD2 (proteína activadora de GTPasa; GAP) de Salmonella Typhimurium actúan cooperativamente para proteolizar a Rab32 y prevenir su reclutamiento hacia la SCV, favoreciendo la supervivencia de la bacteria en macrófagos, así como su colonización sistémica y virulencia en ratones. Durante su ciclo de vida, Salmonella interactúa con amebas y otros protozoos fagocíticos en el ambiente. La capacidad de Salmonella para sobrevivir intracelularmente en amebas, incluyendo en la ameba modelo Dictyostelium discoideum, se ha descrito sin profundizar en los mecanismos moleculares y factores de virulencia involucrados. Nuestro grupo ha reportado que S. Typhimurium requiriere de los T3SS-1 y T3SS-2 para sobrevivir dentro de D. discoideum, residiendo intracelularmente en un compartimiento tipo SCV, similar a lo descrito previamente en macrófagos. Además, D. discoideum comparte con macrófagos muchas de las proteínas asociadas a fagosomas, incluyendo a Rab32. De hecho, en esta ameba existen 4 proteínas homólogas a Rab32 (Rab32A−D), siendo Rab32A la única identificada en fagosomas y asociada a la “vacuola contenedora de Legionella” (LCV). En este trabajo, nos propusimos determinar si los efectores GtgE y SopD2 contribuyen a la supervivencia intracelular y virulencia de S. Typhimurium en D. discoideum al proteolizar a la proteína Rab32A e impedir que sea reclutada hacia la SCV. Para esto, se generaron las mutantes ΔgtgE, ΔsopD2 y ΔgtgE ΔsopD2 de S. Typhimurium y se evaluó su supervivencia intracelular en D. discoideum mediante ensayos de infección. Además, se evaluó la virulencia de estas mutantes mediante ensayos de retardo del desarrollo social en la ameba. Todas las mutantes mostraron un incremento en su internalización y una disminución en su supervivencia intracelular respecto a la cepa silvestre. Asimismo, las mutantes fueron incapaces de retardar el desarrollo social de ameba, a diferencia de la cepa silvestre. La complementación en trans de las mutantes ΔgtgE y ΔsopD2 restauró los niveles silvestres de internalización, supervivencia intracelular y capacidad para retrasar el ciclo social de la ameba. Paralelamente, mediante análisis bioinformáticos se determinó que las 4 proteínas Rab32 de D. discoideum comparten una alta similitud aminoacídica con proteínas Rab32 de mamífero, conservando incluso el motivo de secuencia reconocida por GtgE. Para evaluar la actividad proteolítica de GtgE sobre Rab32A, se generó una fusión Rab32A-6xHis para su expresión recombinante en una cepa de Escherichia coli que también expresa el efector GtgE silvestre o una variante sin actividad catalítica (GtgEH151A). La proteólisis de Rab32A-6xHis se observó al inducir la expresión de GtgE silvestre y no la variante GtgEH151A. Por último, se generó un linaje de D. discoideum que expresa una fusión GFP-Rab32A para monitorear su localización subcelular mediante microscopia confocal en amebas infectadas con la cepa silvestre o una mutante ΔgtgE ΔsopD2 de S. Typhimurium. En ausencia de infección, GFP-Rab32A se acumuló alrededor de compartimientos intracelulares de tamaño variable. Esta distribución no se vio alterada en amebas infectadas con la cepa silvestre o con la mutante ΔgtgE ΔsopD2. En conjunto, los resultados obtenidos indican que GtgE y SopD2 contribuyen a la supervivencia intracelular y virulencia de S. Typhimurium en D. discoideum y sugieren que las 4 proteínas Rab32 de la ameba serían blancos potenciales de GtgE, siendo Rab32A efectivamente proteolizada por el efector. Por otro lado, Rab32A se asocia a compartimientos membranosos intracelulares en D. discoideum, en una distribución subcelular que no cambia durante la infección por S. Typhimurium bajo las condiciones experimentales analizadas.