Papel de las isoformas 2 y 4 del canal hcn en el manejo del ca2+ intracelular en cardiomiocitos como mecanismo asociado a la generación de fibrilación auricular

Abstract

Marco teórico: La Fibrilación Auricular (FA) es la taquiarritmia sostenida más frecuente, y un problema cuya prevalencia ha ido en aumento en los últimos años. El conocimiento parcial de los mecanismos que originan esta patología y la imposibilidad de revertir la remodelación, tanto estructural como eléctrica del corazón, asociado a la gran morbimortalidad, disminución de calidad de vida y altos costos para el sistema de salud, la convierten en objeto de estudio en la actualidad. Los canales HCN son canales catiónicos no selectivos, permeables principalmente a cationes monovalentes y cumplen un papel fundamental en el automatismo cardíaco, encontrándose altamente expresados en células del nodo sinoauricular, en comparación con los cardiomiocitos auriculares en condiciones fisiológicas. Sin embargo, diversos trabajos han demostrado que la expresión de las isoformas HCN2 y HCN4 aumenta en cardiomiocitos auriculares de pacientes con FA, sin existir consenso de cómo este incremento de expresión podría estar relacionado con el desarrollo de esta enfermedad. A nivel celular, la FA presenta alteraciones en el manejo del Ca2+ intracelular, con una mayor frecuencia de eventos conocidos como sparks, los que reflejan la activación de un número reducido de receptores de ryanodina, generando la liberación local de Ca2+ desde el retículo sarcoplasmático y la activación del intercambiador electrogénico Na+-Ca2+ (NCX). De esta forma, la mayor frecuencia de sparks llevaría a la despolarización de la membrana plasmática y a la aparición de post-potenciales tardíos, mecanismo reconocido en la FA. Sin embargo, cómo el aumento de expresión de los canales HCN2 y/o HCN4 está relacionado con la alteración de la dinámica del Ca2+ intracelular aún no ha sido establecido. Hipótesis: Si se sobre-expresan las isoformas 2 o 4 del canal HCN en cardiomiocitos de rata neonata entonces, se modificará el manejo de Ca2+ intracelular y se correlacionará con eventos clínicos de FA en pacientes. Objetivo general y metodología: el objetivo de este proyecto fue determinar el efecto de la sobreexpresión de las isoformas del canal, en particular, HCN2 o HCN4, en el manejo de Ca2+ intracelular de cardiomiocitos de rata neonata, y su asociación con la aparición de eventos clínicos de FA en pacientes. Con el uso de técnicas de bioquímica, biología molecular y fluorescencia fueron registrados los cambios en el manejo de Ca2+ intracelular en cardiomiocitos de rata neonata aislados sobre-expresando los canales HCN2 o HCN4, lo cual fue realizado mediante la infección con adenovirus recombinantes para evaluar los cambios en la dinámica de Ca2+ intracelular, tanto en un grupo control como en otro sobre-expresando, ya sea HCN2 o HCN4, y adicionando además Ivabradina, un inhibidor especifico de HCN. Los cambios en el manejo del Ca2+ intracelular fueron determinados con el uso de una sonda fluorescente sensible a Ca2+ en presencia y ausencia de Ivabradina, durante el proceso de infección. Finalmente, fue diseñado un estudio clínico para evaluar los cambios de expresión génica y proteica, a través de qPCR y WB, para la detección y evaluación de la expresión de las isoformas del canal HCN y del intercambiador NCX1. Resultados: Se logró generar sobre-expresión de la isoforma hHCN2 en cardiomiocitos de rata neonata. El análisis de los transitorios de Ca2+ sobre-expresando HCN2 mostró una menor amplitud en este grupo, así como mayor tau al aplicar cafeína, sin cambios en las otras variables. Además, HCN2 fue capaz de inducir calcium waves, que se revertían al co-incubar con Ivabradina. En relación con el estudio clínico, se reclutaron 18 pacientes (nueve por rama), todos con fracción de eyección preservada y adultos menores a 65 años. No fueron encontradas diferencias en la expresión génica ni proteica para ninguna de las isoformas de HCN evaluadas (HCN1, HCN2 y HCN4), ni tampoco para el intercambiador NCX1 o su proporción entre la fracción clivada y el total, entre los grupos con FA permanente comparado con los pacientes en ritmo sinusal. Conclusión: La sobre-expresión de HCN2 en cardiomiocitos de rata neonata determina una alteración en la dinámica de Ca2+ y sustrato proarrítmico. De la misma forma, en pacientes con FA permanente no existe diferencia en cuanto a la expresión génica o proteica de las isoformas del canal HCN o del intercambiador NCX1 comparado con pacientes sin alteración

del sistema excito-conductor (ritmo sinusal). Nuestros resultados sugieren que la sobre- expresión de HCN2 podría ser suficiente para la generación de un sustrato arritmogénico a

nivel de celular, sin embargo, en pacientes con FA de origen valvular y fracción de eyección preservada no es necesaria la sobre-expresión de este canal para la génesis y progresión de la enfermedad.

Background: Atrial Fibrillation (AF) is the most frequently sustained tachyarrhythmia and a problem whose prevalence has increased in recent years. The partial knowledge of the mechanisms that originate this pathology and the impossibility of reversing the heart's structural and electrical remodeling, associated with high morbidity and mortality, decreased quality of

life, and elevated health system costs, make it an object of study. HCN channels are non- selective cation channels, mainly permeable to monovalent cations, and play a fundamental

role in spontaneous cardiac beat, being highly expressed in cells of the sinoatrial node, compared to atrial cardiomyocytes under physiological conditions. However, previous works have shown that the expression of the HCN2 and HCN4 isoforms increases in atrial cardiomyocytes from patients with AF, without a consensus as to how this increase in expression could be related to the development of this disease. At the cellular level, AF presents alterations in the management of intracellular Ca2+, with a higher frequency of events known as sparks, which reflect the activation of a reduced number of ryanodine receptors, generating the local release of Ca2+ from the sarcoplasmic reticulum and activation of the Na+-Ca2+ (NCX) electrogenic exchanger. Thus, the higher frequency of sparks would lead to depolarization of the sarcolemma and the appearance of delayed afterdepolarizations, a mechanism recognized in AF. However, how the increased expression of the HCN2 or HCN4 channels is related to the alteration of intracellular Ca2+ dynamics has not yet been established. Hypothesis: If HCN channel isoforms 2 or 4 are overexpressed in neonatal rat cardiomyocytes, then intracellular Ca2+ handling will be modified and correlated with clinical events of AF in patients. General objective and methodology: This project aimed to determine the effect of overexpression of the HCN isoforms, in particular HCN2 or HCN4, on managing intracellular Ca2+ of neonatal rat cardiomyocytes and its association with the occurrence of clinical events in AF patients. With the use of biochemistry, molecular biology, and fluorescence techniques, the changes in the management of intracellular Ca2+ were recorded in isolated neonatal rat cardiomyocytes over-expressing the HCN2 or HCN4 channels, which was carried out through infection with recombinant adenoviruses, both in a control group and in another over-expressing either HCN2 or HCN4, and adding Ivabradine, a specific HCN inhibitor. Changes in the management of intracellular Ca2+ were determined using a fluorescent probe sensitive to Ca2+ in the presence and absence of Ivabradine during the viral infection process. Finally, a clinical study was designed to evaluate gene and protein expression changes through qPCR and WB to detect and evaluate the expression of the HCN channel and NCX1 exchanger isoforms. Results: It was possible to generate over-expression of the hHCN2 isoform in neonatal rat cardiomyocytes. The analysis of the Ca2+ transients over-expressing HCN2 showed a lower amplitude in this group and higher tau when applying caffeine without changes in the other variables. In addition, HCN2 induced calcium waves, which were reversed by co-incubating with Ivabradine. In the clinical trial, 18 patients (nine per arm) were recruited, all with preserved ejection fraction and under 65 years old. No differences were found in gene or protein expression for any of the HCN isoforms evaluated (HCN1, HCN2, and HCN4), nor for the NCX1 exchanger or its ratio between the cleaved fraction and the total, between the groups with permanent AF and sinus rhythm. Conclusion: HCN2 overexpression in neonatal rat cardiomyocytes determines an altered Ca2+ dynamics and proarrhythmic substrate. Similarly, in patients with permanent AF, there is no difference in gene or protein expression of the isoforms of the HCN channel or the NCX1 exchanger compared with patients without abnormalities in the cardiac conducting system (sinus rhythm). Our results suggest that HCN2 overexpression could be sufficient for generating an arrhythmogenic substrate at the cellular level; however, in patients with AF from valvular etiology and preserved ejection fraction, overexpression of this channel is not necessary for the origin and progression of the disease.