Análisis Funcional y Estructural del Promotor del Gen CBF-1 de Eucalyptus Globulus en la Respuesta a Estrés por Frío

Abstract

En Chile, Eucalyptus globulus es una de las especies forestales de mayor importancia, debido a su rápido crecimiento y a la calidad de su madera. Estas características hacen que sea una especie de alto rendimiento y de principal interés para la industria de la celulosa. Sin embargo, la especie resulta extremadamente sensible a las bajas temperaturas, por lo que ocurren grandes pérdidas en plantaciones jóvenes de Eucalyptus globulus. En este contexto, la biotecnología forestal se perfila como una herramienta eficaz para comprender y proponer soluciones a éste y a otros problemas. En el plano de la investigación científica, se han realizado importantes avances en la determinación de los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta a estrés por frío en Eucalyptus globulus. Entre ellos, el aislamiento y secuenciación de una serie de genes involucrados en este proceso, como el gen EgCBF-1. Este gen codifica para un factor de transcripción que es activado por frío y que es capaz de activar numerosos genes de respuesta a estrés abiótico. En esta tesis se realizó un análisis estratégico que incluyó un recuento del panorama actual de la industria forestal chilena y los principales avances biotecnológicos atingentes. A través del análisis de la cadena de valor, se propuso un plan de negocios para la introducción de una variedad de Eucalyptus globulus tolerante a las bajas temperaturas en la industria forestal chilena. Se determinó que las principales ventajas para el desarrollo de este proyecto son las políticas gubernamentales favorables que incentivan el desarrollo biotecnológico del sector forestal y la consistencia de la industria forestal chilena. Se determinó que las principales desventajas son la carencia de una metodología para la transformación de especies de eucaliptos y la escasez de información a nivel social y legislación relativa al uso de organismos genéticamente modificados. La parte experimental de este trabajo de tesis se orientó al análisis funcional y estructural del promotor del gen EgCBF-1 en respuesta al estrés por frío. Se aisló y secuenció el promotor EgCBF-1 y se desarrollaron construcciones para estudios de funcionalidad. Se obtuvo una secuencia de 776 pares de bases río arriba del sitio de inicio de la transcripción del gen CBF-1 de Eucalyptus globulus, correspondiente a un segmento del promotor de dicho gen. En cuanto al análisis estructural, se confirmó la presencia de una serie de elementos de respuesta a estrés, entre ellos, cinco sitios de unión para el factor de transcripción EgICE-1, cuyo rol es clave en la respuesta al estrés provocado por las bajas temperaturas. Se determinó además, que éste y otros elementos de respuesta, están también presentes en promotores de genes ortólogos al promotor EgCBF-1. Se utilizaron dos estrategias para evaluar la funcionalidad del promotor: ensayos de funcionalidad mediante transformación transitoria en Nicotiana benthamiana y ensayos en plantas trnasgénicas de Arabidopsis thaliana. En ambos casos se utilizó el gen reportero GUS bajo el control del promotor en estudio.