Efecto de la Adición de Extremos Polipeptídicos Hidrofóbicos en la Expresión y Purificación por HIC de cutinasas

Abstract

El presente trabajo tuvo como objetivo estudiar el efecto de la adición de un extremo polipeptídico hidrofóbico a una enzima, en particular una cutinasa, en la producción, recuperación y purificación por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC). Para realizar este estudio, se escogieron 3 combinaciones de los aminoácidos tirosina (Y), triptófano (W) y prolina (P), y se realizaron mutaciones en la enzima, mediante la técnica de “Polymerase Chain Reaction” (PCR). Se obtuvieron satisfactoriamente las mutantes CutinasaWPWP y Cutinasa-YYY, y en el caso de la combinación YPYPYP se obtuvo una secuencia más larga en 32 aminoácidos que la diseñada, denominada YPY*. Como resultado se obtuvo que dichos extremos aumentaron la hidrofobicidad superficial global teórica de la proteína en un 12,4% en el caso de la Cutinasa-YYY, en un 16,6% en el caso de la Cutinasa-WPWP y en el caso de una correcta construcción de la Cutinasa-YPYPYP, se hubiera incrementado en un 14,1%. En el caso de la Cutinasa-YPY* se estima que la hidrofobicidad superficial teórica es mayor a este último valor, aunque no pudo ser calculado, debido a que no fue posible aplicar los supuestos que permitían determinarla. Las cepas recombinantes de E. coli que expresan estas proteínas se crecieron e indujeron bajo condiciones definidas, y se les extrajo desde la región periplasmática de la célula, obteniéndose una gran variabilidad (> 50 % en algunos casos) en los resultados en cuanto a actividad y proteína total presentes en las muestras. En el caso de la cutinasa mutada con la secuencia YYY se observó una disminución drástica de la concentración de proteína, en comparación con la cepa nativa, al igual que escasa actividad cutinasa. Esto tendría relación con la ausencia de prolina en el extremo adicionado, ya que este aminoácido, más que otorgar hidrofobicidad a la secuencia, le otorgaría estabilidad, debido a que permite la total exposición del extremo al medio y evita que interactúe con otras regiones de la proteína. Se descartó esta mutante durante el proceso de purificación, debido a la casi nula recuperación de proteína.