Regulación de la expresión y función de la polimerasa del antígeno O de Shigella flexneri 2a : rol del antiterminador RfaH y de los reguladores del largo de cadena Wzz

Abstract

Shigellɑ spp. son bacilos Gram negativo pertenecientes a la familia Enterobɑcteriɑceɑe. Son Patógenos exclusivos del ser humano causantes de shigelosis, una enfermedad severa que produce inflamación y destrucción del epitelio intestinal. Las infecciones por Shigellɑ constituyen un problema de Salud Pública a nivel mundial, especialmente en países en vías de desarrollo. De las especies de Shigella; S. ƒlexneri y S. sonnei son responsables de la mayor mortalidad, siendo S. ƒlexneri 2a el serotipo más importante en Chile.

Uno de los factores que contribuyen a la patogenicidad de S. lexneri es el lipopolisacárido, el cual confiere a la bacteria resistencia al complemento y participa directa e indirectamente en la destrucción de la mucosa intestinal. Sin embargo, el lipopolisacárido de Shigella ha sido poco estudiado en comparación con otras enterobacterias y no se conocen los mecanismos que regulan su expresión.

El lipopolisacárido es el principal componente de la membrana externa de las bacterias Gram negativo. Es un glicolípido complejo constituido por tres dominios: el lípido A, el “core” de oligosacáridos y el antígeno O formado por subunidades repetidas de azúcares que se proyectan hacia el exterior de la bacteria. La polimerización del antígeno O la realiza la enzima polimerasa Wzy y el largo de la cadena de antígeno O es regulado por Wzz. En S. ƒlexneri el antígeno O presenta una distribución bi-modal o dos lagos preferenciales de cadena: un antígeno O de moda corta (S-AgO) regulada por la proteína WzzB y uno de moda larga (VL-AgO) regulada pr la proteína WzzpHS2, codificadas en el cromosoma y en el plasmidio pHS2, respectivamente.

Nuestra investigación se ha dirigido al estudio de los mecanismos que regulan la biosíntesis del lipopoliscárido. Desmostramos que en S. ƒlexneri 2ª 2457T existe una regulación diferencial, fase dependiente, de la sístesis de antígeno O. En fase exponencial tardía y estacionaria aumenta la moda VL- AgO mientras que la moda S-AgO se mantiene constante durante el crecimiento. El aumento del antígeno O se correlaciona con el aumento de la transcripción del gen rƒɑH y de la cantidad de esta proteína. RfaH es un antiterminador transcripcioanl, que permite la transcripción de operones largos, superando las pausas en la transcripción. Regula un gran número de componentes de membrana en enterobacterias, entre ellos el lipopolisacárido. El operón ѡbɑ es el encargado de la síntesis de antígeno O en S. ƒlexneri y presenta una secuencia ops en su región 5’ UTR, reconocida por RfaH.

En una mutante ΔrƒɑH (MSF487) la polimerización de antígeno O se ve afectada severamente, observándose, en geles de poliacrilamida teñidos con plata, moléculas de antígeno O de bajo peso molecular, menor cantidad de S-AgO y ausencia de VL-AgO. El defecto en la polimerización en esta mutante es el resultado de una menor expresión del gen ѡzy, que codifica para la polimerasa del antígeno O, medida por ensayos de RT-PCR en tiempo real. El gen ѡzy es el último gen del operón ѡbɑ, por lo tanto su expresión depende de la función RfaH.

La complementación de la mutante MSF487 con el gen ѡzy restauró la síntesis de antígeno O de alto peso molecular. Esto sugiere que la cantidad de Wzy es importante no sólo para la polimerización, sino también para la distribución modal. Por otra parte, el aumento del dosaje génico ѡzzB o ѡzzpHS2 desplazó la polimerización hacia la moda que es controlada por el regulador sobreexpresado, lo que indica que el nivel de estos reguladores también es crucial para determinar la distribución modal.

De este modo, estos resultados indican que debe existir un balance entre los niveles de la polimerasa y los reguladores del largo de cadena y además, de acuerdo a las hipótesis propuestas para el mecanismo de acción de Wzz, apuntan a la posible formación de un complejo multiproteico encargado de la síntesis de antígeno O. Para probar esta hipótesis se realizaron ensayos de entrecruzamiento in vivo e in vitro. Estos ensayos mostraron que WzzB y Wzy son capaces individualmente de formar estructuras de mayor peso molecular, posiblemente correspondientes a un dímero o trímero. Sin embargo, no lograron resolver la interacción entre WzzB y Wzsy.

Los resultados de esta Tesis indican la importancia de RfaH en la síntesis de antígeno O en S. ƒlexneri, y su efecto sobre la transcripción de ѡzy. Además, señalan que la expresión de los genes ѡzy, ѡzzB y ѡzz pHS2 está finamente regulada para determinar un apropiado balance entre las proteínas responsables de la polimerización y distribución modal, para producir un antígeno O normal.