Metabolitos del etanol con efectos en el sistema nervioso central : separación de los regioisómeros salsolinol e isosalsolinol y sus respectivos enantiómeros R y S

Abstract

Las propiedades reforzantes del etanol en el sistema nervioso central (SNC), que se postula son responsables de la auto-administración repetida de alcohol, se deben al aumento de la liberación de dopamina, inducido por el etanol, en el núcleo accumbens, área del sistema mesolímbico inervada por neuronas del área tegmental ventral. Esta acción parece estar mediada por su metabolito primario, el acetaldehído, producido en el cerebro por la oxidación del etanol a través de dos sistemas enzimáticos alternativos: la catalasa cerebral y el citocromo p450 2E1 (CYP2E1). Las ratas se autoadministran tanto etanol como acetaldehído directamente en el área tegmental ventral. La concentración necesaria para producir efectos reforzantes es menor para el acetaldehído que para el etanol, indicando que este metabolito del alcohol es un agente reforzante más potente que el etanol. El acetaldehído se puede condensar con la dopamina formando una mezcla de salsolinol e isosalsolinol. Las ratas se autoadministran salsolinol comercial (que contiene entre un 8 % y un 15 % de isosalsolinol) directamente en el área tegmental ventral. Las concentraciones autoadministradas son aún menores que las de acetaldehído, indicando una mayor potencia del salsolinol (y/o del isosalsolinol) como agente reforzante. Tanto el salsolinol como el isosalsolinol tienen un centro quiral y existen como los enantiómeros R y S. En el cerebro, el salsolinol sería producido por al menos tres vías: 1) condensación no enzimática del acetaldehído con dopamina, que produce la mezcla racémica de (R,S)-salsolinol y, posiblemente en menor proporción, una mezcla racémica de (R,S)- isosalsolinol; 2) condensación enzimática del acetaldehído con la dopamina, que produciría preferencialmente (R)-salsolinol y 3) condensación enzimática del ácido pirúvico con dopamina seguido de descarboxilación del producto, lo cual produciría preferencialmente (R)-salsolinol. No existe claridad acerca de cuál de los isómeros, salsolinol o isosalsolinol (o la mezcla de ambos), es responsable de las propiedades reforzantes observadas ni, específicamente, cuál de los enantiómeros - R o S - de estos compuestos es el que tiene una mayor actividad biológica. Para poder determinar cuál de los isómeros presentes en el salsolinol comercial -(R)- salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol o (S)-isosalsolinol- es el que tiene una mayor actividad biológica y para poder profundizar en los efectos que tiene el consumo de etanol sobre la producción de ellos in vivo, es necesario poder contar con metodologías que permitan la producción de estos isómeros en forma separada y a su vez que permitan cuantificarlos en muestras de origen biológico. En este sentido, los principales resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis fueron los siguientes: (i) Se desarrolló una metodología de HPLC de apareamiento iónico en columna de gel de sílice-C18 acoplada a detector electroquímico capaz de separar y cuantificar dopamina, salsolinol e isosalsolinol en aproximadamente 30 min. En este sistema, la dopamina eluye primero (13,0 min. aprox.) seguida del salsolinol y el isosalsolinol (14,4 min. aprox y 26,1 min. aprox), permitiendo una buena separación y cuantificación de estos analitos en concentraciones desde 10-8 M. (ii) Se estableció que las sustancias separadas mediante HPLC de apareamiento iónico a partir del salsolinol comercial, SC1 y SC2, corresponden efectivamente a salsolinol (tiempo de retención 14,4 min. aprox.) e isosalsolinol (tiempo de retención 26,1 min. aprox) sobre la base de que: a) El tiempo de retención de SC1 (14,4 min. aprox.) es menor que el tiempo de retención de SC2 (26,1 min. aprox.) y, teóricamente, cabe esperar que el salsolinol eluya antes que el isosalsolinol por tener sus grupos hidroxilo más disponibles para interactuar con la fase móvil. b) La razón entre las áreas de los picos del salsolinol comercial SC1 (tiempo de retención 14,4 min. aprox.) y SC2 (tiempo de retención 26,1 min. aprox.) se corresponde con los porcentajes de salsolinol (92%) e isosalsolinol (8%) en el salsolinol comercial determinados por 1H-RMN. c) El peso molecular de las sustancias separadas a partir del salsolinol comercial, SC1 y SC2, se corresponde con el peso molecular del salsolinol e isosalsolinol (179 g/mol). (iii) Se determinó que la dopamina se degrada (posiblemente por autoxidación) en solución a pH 7,4 de acuerdo a una cinética de orden cero, mientras que el salsolinol y el isosalsolinol lo hacen de acuerdo a una cinética de orden uno, siendo la velocidad de oxidación del isosalsolinol 10 veces mayor que la del salsolinol. (iv) Se desarrolló una metodología de HPLC de fase inversa en columna de gel de sílice modificado con β-ciclodextrina capaz de separar y cuantificar dopamina, (R)- salsolinol y (S)-salsolinol en aproximadamente 40 minutos. En este sistema, la dopamina eluye primero (22,9 min. aprox) seguida de (S)-salsolinol (26,9 min. aprox.), (R)-salsolinol (29,9 min. aprox.) y el (R) y (S)-isosalsolinol (31,3 y 32,9 min. aprox), permitiendo una buena separación y cuantificación de dopamina, (S)- salsolinol y (R)-salsolinol en concentraciones desde 10-8 M. Si bien el isosalsolinol pudo ser separado de dopamina y de los enantiómeros R y S del salsolinol, no se logró separar completamente los enantiómeros R y S del isosalsolinol entre sí. A futuro, estas metodologías permitirán la detección y cuantificación de los enantiómeros en muestras de origen biológico y la administración selectiva de un enantiómero específico directamente en el cerebro de las ratas, ampliando así los conocimientos que se tienen sobre las propiedades reforzantes del etanol como una prodroga y cómo éstas pueden ser mediadas por el salsolinol

The reinforcing properties of ethanol in the central nervous system (CNS), believed to be responsible for the repeated self-administration of ethanol, are due to the increase of dopamine release -induced by ethanol- in the nucleus accumbens, a part of the mesolimbic system innerved by neurons from the ventral tegmental area. This action of ethanol seems to be mediated by its primary metabolite, acetaldehyde, which is produced in the brain from ethanol oxidation by two alternative enzymatic systems: brain catalase and cytochrome p450 2E1 (CYP2E1). Rats selfadminister both ethanol and acetaldehyde directly into the ventral tegmental area. The concentration needed to produce the reinforcing effects is lower for acetaldehyde than for ethanol, suggesting that this metabolite is a more powerful reinforcing agent than ethanol. Acetaldehyde can condense with dopamine to form salsolinol and isosalsolinol. Rats selfadminister commercially available salsolinol (which contains between 8% to 15% of isosalsolinol) directly in the ventral tegmental area. The concentrations of salsolinol selfadministered are even lower than acetaldehyde concentrations, suggesting that salsolinol (and/or isosalsolinol) is an even more powerful reinforcing agent. Both salsolinol and isosalsolinol have a chiral center and exist as the R and S enantiomers. In brain, salsolinol could be produced by at least three pathways. 1) non-enzymatic condensation of acetaldehyde with dopamine, which produces a racemic mixture of R and S salsolinol and possibly, to a lesser extent, a racemic mixture of R and S isosalsolinol; 2) enzymatic condensation of acetaldehyde with dopamine which would produce, preferentially, (R)-salsolinol and 3) enzymatic condensation of pyruvic acid with dopamine followed by decarboxylation of the condensation product wich would produce, preferentially, (R)-salsolinol. There is no clarity about which of the isomers, salsolinol or isosalsolinol (or both), is primarily responsible for the observed reinforcing properties, nor, specifically, about which of the enantiomers –R or S- of these compounds has a greater biological activity. In order to determine which of the isomers present in comercially available salsolinol –(R)- salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol and (S)-isosalsolinol- has stronger biological activity and in order to better understand the effects of ethanol consumption on the in vivo synthesis of these isomers, methodologies that allow us to produce these substances independently and methodologies that allow us to quantify them in biological samples are needed. In relation to this, the main results obtained in this thesis were the following: (i) An ion pairing HPLC methodology using a silicagel-C18 column coupled to an electrochemical detector, able to separate and quantify dopamine, salsolinol and isosalsolinol in approximately 30 min., was developed. By this methodology, dopamine elutes first (13.0 min. approx.) followed by salsolinol and isosalsolinol (14.4 min. approx. and 26.1 min. approx.), allowing a good separation and quantification of these analytes in concentrations above 10-8 M. (ii) The substances separated by ion pairing HPLC from commercially available salsolinol correspond to salsolinol (retention time of 14.4 min. approx.) and isosalsolinol (retention time of 26.1 min. approx.). This was established on the basis that: a) The retention time of SC1 (14.4 min. approx.) is lower than the retention time of SC2 (26.1 min. approx.) and, theoretically, it is expected that salsolinol elutes before than isosalsolinol because salsolinol has its hydroxyl groups more available to interact with the mobil phase than isosalsolinol. b) The ratio between the areas of the peaks observed for commercially available salsolinol SC1 (retention time of 14.4 min. approx.) and SC2 (retention time of 26.1 min. approx.) is in agreement with the expected percentages of salsolinol (92%) and isosalsolinol (8%) in the commercially available salsolinol as determined by 1H-NMR. c) The molecular weight of the substances separated from commercially available salsolinol, SC1 and SC2, is the same as the molecular weight of salsolinol and isosalsolinol (179 g/mol). (iii) It was determined that dopamine degradation (possibly by autoxidation) at pH 7.4 follows zero order kinetics, while salsolinol and isosalsolinol oxidations follow first order kinetics. The rate of oxidation of isosalsolinol is about 10 times higher than the rate of oxidation of salsolinol. (iv) A reversed phase HPLC methodology using a silicagel-β-cyclodextrin coupled to an electrochemical detector, able to separate and quantify dopamine, (R)-salsolinol and (S)-salsolinol in about 40 minutes, was developed. In this methodology, dopamine elutes first (22.9 min. approx.), followed by (S)-salsolinol (26.9 min. approx.), (R)- salsolinol (29.9 min. approx.) and (R) and (S)-isosalsolinol (31.3 and 32.9 min. approx.), allowing a good separation and quantification of dopamine, (S)-salsolinol and (R)-salsolinol in concentrations above 10-8 M. Although this methodology succeeded in separating isosalsolinol from dopamine and from the R and S enantiomers of salsolinol, it was unable to completely resolve (R)-isosalsolinol from (S)-isosalsolinol. In the future, these methodologies will allow the detection and quantification of these regioisomers and enantiomers in biological samples and will allow the selective administration of a specific enantiomer directly into rat brain, extending our knowlegde on the reinforcing properties of ethanol as a prodrug and on how these properties may be mediated by salsolinol