Importancia de las interfaces monómero-monómero y dímero-dímero en la estabilidad y regulación alostérica de la fosfofructoquinasa-2 de Escherichia coli

Abstract

La fosfofructoquinsa-2 (Pfk-2) de E. coli transfiere eficientemente un grupo fosfato al hidroxilo 1 de fructosa-6-P utilizando MgATP, reacción cuya velocidad es regulada negativamente mediante un sitio alostérico para MgATP. Análisis filogenéticos y la reciente obtención de la estructura cristalográfica de la Pfk-2, sitúan a esta enzima entre un grupo de quinasas de azúcares y vitaminas denominado superfamilia de la riboquinasa. Las enzimas representantes de esta superfamilia comparten un dominio común tipo α/β/α que contiene la mayoría de los determinantes estructurales que originan el sitio activo. Por otra parte, estudios cristalográficos, y en algunos casos bioquímicos, han descrito a los miembros de esta familia como tetrámeros, trímeros, dímeros y monómeros que presentan arreglos cuaternarios que ocurren a través de diferentes superficies de interacción. En ausencia de sustratos o en presencia de fructosa-6-P, la Pfk-2 se ha descrito como un homodímero de 66 KDa, cuya interfaz se crea a través de elementos de estructura secundaria adicionales al dominio conservado α/β/α de los representantes de la superfamilia de la riboquinasa. Sin embargo, en la Pfk-2 y en sus homólogos más cercanos, no se han determinado las características estructurales de sus subunidades aisladas y por ende se desconoce el papel de la estructura cuaternaria en cuanto a la función y estabilidad en estos tipos de dímeros. Por otro lado, la unión de MgATP al sitio alostérico de la Pfk-2 tiene como resultado la asociación del dímero nativo en tetrámero, lo cual ha sido correlacionado con la inhibición de la actividad enzimática. La inhibición alostérica y el concomitante cambio de estado de agregación son características exclusivas para la Pfk-2 de E. coli, ya que homólogos cercanos capaces de fosforilar otros azúcares no presentan esta característica. De esta forma, la Pfk-2 de E. coli presenta dos tipos de interfaz: una estructuralmente conservada, relacionada con la arquitectura del sitio activo y otra no conservada, relacionada con la regulación alostérica de su actividad catalítica. En esta tesis se perturbó la estructura de la Pfk-2 mediante la utilización de agentes caotrópicos, temperatura y mutagénesis sitio dirigida, con el propósito de conocer el papel de las interacciones cuaternarias en la estabilidad de la enzima, catálisis enzimática y regulación alostérica. El desplegamiento de la Pfk-2 inducido por GdnHCl se determinó mediante medidas de actividad enzimática, fluorescencia intrínseca, dicroísmo circular, cromatografía de exclusión y dispersión dinámica de luz, para caracterizar los cambios conformacionales involucrados en la disociación y desplegamiento de la enzima. El tratamiento con GdnHCl de la configuración dimérica de la Pfk-2 mostró la presencia de un intermediario inactivo con propiedades fluorescentes similares al estado desplegado, pero que retiene alrededor de un 30 % de la señal de dicroísmo circular correspondiente al dímero nativo. Para evaluar el estado de agregación del intermediario, se determinó el efecto de la concentración de proteína en las transiciones que lo originan, con el fin de detectar los cambios conformaciones acoplados a la disociación de las subunidades de la Pfk-2. Esta aproximación experimental, junto a experimentos de cromatografía de exclusión y dispersión dinámica de luz, indica que el intermediario corresponde a un monómero expandido con un radio hidrodinámico de ~38 Å, lo que equivale a un radio hidrodinámico 12 Å mayor que el calculado para un monómero compacto de 33 KDa (el tamaño de la subunidad de la Pfk-2). Estos resultados permitieron proponer un mecanismo mínimo para el desplegamiento de la Pfk-2 representado por el siguiente modelo, N2↔2I↔2U donde N2 representa el dímero nativo, I es el intermediario monomérico y U es el estado desplegado de la enzima. El ajuste de este modelo a las transiciones conformacionales observadas en presencia de GdnHCl, indicó que los cambios conformacionales que ocurren en la transición N2↔2I dan cuenta del 75 % de la estabilidad del dímero nativo N2 respecto al estado desplegado. Por lo tanto, se postula que la pérdida de estructura cuaternaria inducida por GdnHCl, es un proceso que no puede diferenciarse de la pérdida de una parte importante de la estructura secundaria de las subunidades. Por otra parte, el desplegamiento de la Pfk-2 a partir de su configuración tetramérica, obtenida en presencia de MgATP, mostró la formación de un intermediario tetramérico que se caracterizó por presentar un espectro de fluorescencia alterado respecto al tetrámero nativo. La disociación del tetrámero transcurre en un estrecho intervalo de agente caotrópico sin una clara prueba de la acumulación de dímeros o monómeros compactos. Por el contrario, sólo se observa la acumulación de un intermediario monomérico desestructurado con propiedades similares al anteriormente descrito. Estos resultados indican que los monómeros aislados de la Pfk-2 no son estabilizados por la unión de MgATP al sitio alostérico Con el fin de estudiar las propiedades estructurales del monómero en ausencia de GdnHCl, se perturbó la interfaz monómero-monómero de la Pfk-2 mediante el cambio de L93 por alanina. La mutante se caracterizó como un monómero inactivo, con un mayor grado de estructura secundaria y 9 Å más compacto que el intermediario monomérico obtenido en presencia de GdnHCl. No obstante, en comparación con su conformación asociada la mutante presentó una importante pérdida de estructura secundaria. En condiciones donde la mutante se encuentra disociada, el aumento de la temperatura y el tratamiento con GdnHCl, mostraron que esta especie presenta una estabilidad marginal ya que la pérdida de su estructura secundaria no origina transiciones sigmoides como las obtenidas a partir de su configuración dimérica. En conjunto estos resultados indican que las subunidades aisladas de la Pfk-2 carecen de interacciones terciarias, las que solo se establecen cuando la enzima adquiere su estructura cuaternaria. El papel de la interfaz dímero-dímero en la regulación alostérica de la Pfk-2 se analizó mediante la caracterización cinética y la capacidad de formar tetrámeros de una serie de mutantes originadas por la remoción sistemática de residuos y segmentos del extremo carboxilo terminal de la enzima. Estas mutantes se construyeron debido a que experimentos de proteólisis limitada sugerían que el extremo carboxilo terminal de la enzima podría contener residuos que participan en la formación del tetrámero. Se encontró que la remoción de segmentos del extremo carboxilo terminal de la Pfk-2, produce enzimas con una pseudo-afinidad disminuida (elevadas Km aparentes) para MgATP y no forman tetrámeros en presencia del nucleótido. A partir de esta información se generaron dos mutantes puntuales del extremo carboxilo terminal, con el fin de afectar separadamente el aumento de la Km aparente para MgATP de la falla en la formación de tetrámeros. La mutante Y306A mostró parámetros cinéticos y un patrón de inhibición de la actividad enzimática idéntico a los de la enzima silvestre, pero no presentó cambios en el estado de agregación en presencia del nucleótido. Por otra parte, la mutante L307A presentó el mismo comportamiento cinético y estado de agregación en presencia del nucleótido que las mutantes que resultaron al remover segmentos del extremo carboxilo terminal. Estos resultados indican que la formación de tetrámeros no es requisito para la regulación alostérica de la Pfk-2.