Estudio de la interacción de peroxinitrito con oligonucleótidos de secuencia conocida mediante biosensores electroquímicos

Abstract

En esta Memoria se informa sobre el estudio de la absorción y electrooxidación de oligonucleótidos de cadena corta sobre un electrodo de pasta de carbono (CPE) y su aplicación a la evaluación de daño al ADN por peroxinitrito, un agente oxidante biológico. Se trabajó con tres oligonucleótidos, de 24 bases del ADN, uno de ellos contenido 4 secuencias teloméricas humanas y otros dos isómeros de posición del primero. La modificación del electrodo se realizó a través de la absorción directa de las moléculas sobre CPE, aplicando un potencial de 0.5 V por un tiempo predeterminado, en buffer acetato a pH 5.0. Mediante voltamperometría de pulso diferencial se obtuvo una señal analítica a 1.0 V, correspondiente a la oxidación de los residuos de guanina presentes en las moléculas. Se observó una respuesta lineal con el tiempo de acumulación y con la concentración del oligonucleótido utilizado y en todos los casos se evidenció una saturación de la superficie electródica. Con el Oligo 1 (TTAGGG) se obtuvo una respuesta menor que cuando el biosensor es generado utilizando el Oligo 2, que tiene las guaninas agrupadas de a dos o cuando las 12 guaninas están una por medio en la estructura (Oligo 3). Los estudios de interacción con peroxinitrito (ONOO-) fueron realizados en buffer fosfato 0.1 M pH 7.4 a 37° C, medio al que se transfiere el electrodo con el oligonucleótido previamente inmovilizado. Bajo estas condiciones el electrodo modificado presenta una alta estabilidad. En presencia de diferentes concentraciones de ONOO- (100 – 600 µM), se observó una disminución en la respuesta electroquímica de los oligonucleótidos 1 y 3, en cerca del 30% en el caso del oligo 1. A concentraciones altas de peroxinitrito (> 600 µM) se observó un aumento de la respuesta electroquímica, lo que es atribuido a reordenamientos y/o rompimientos en las moléculas, lo que permite que más residuos de guanina queden expuestos a la oxidación electroquímica sobre el electrodo. Este efecto también fue observado a concentraciones más bajas de peroxinitrito (300 µM) pero a tiempos más altos de interacción. En conclusión, es posible utilizar electrodos de pasta de carbono modificados con Oligonucleótidos para la detección de daño sobre el ADN debido a la alta sensibilidad, reproducibilidad y estabilidad que éstos presentan.