Funciones Catalíticas de las Oxidasas de Giberelinas en Fusarium Konzum

Abstract

El hongo filamentoso Fusarium konzum pertenece al complejo taxonómico Gibberella fujikuroi formado por 9 especies biológicas que se han aislado desde distintas plantas y que sintetizan diversos metabolitos secundarios. Dos especies del complejo, F. fujikuroi y F. konzum, producen giberelinas (GAs), diterpenos activos como fitohormonas. Las demás especies no producen GAs aunque contienen los genes respectivos o parte de ellos. En este trabajo se caracterizó la biosíntesis de GAs en la cepa I3 de F. konzum tanto a nivel de las reacciones químicas como de las enzimas que las catalizan y se comparó con la especie bien estudiada, F. fujikuroi. El análisis de GAs endógenas en distintas cepas de F. konzum indicó que el producto principal de la vía metabólica es la lactona 3,13-dihidroxilada GA1. También se encontró ácido giberélico (GA3) aunque en menor cantidad. Mediante la administración de precursores marcados con 14C a los cultivos líquidos, se determinó la secuencia biosintética para GA1 en la que participan como intermediarios el ácido entkaurenoico, el GA12 aldehído, y las giberelinas 3b-hidroxiladas GA14 (C20) y GA4 (C19). La vía 3b-hidroxilada es la principal y la vía no hidroxilada es menor. La reacción de hidroxilación en C13 ocurre al final de la secuencia, sobre el GA4 en cambio la hidroxilación en C3b ocurre en una etapa temprana, a nivel del GA12 aldehído. En las incubaciones con ácido ent-14C-kaurenoico se acumularon los intermediarios 14C-GA14 y 14C-GA4 en tanto que a partir del precursor 14C-GA12 se formó el C20 alcohol (14C-GA15) y el C20 aldehído (14C-GA24) además del producto lactónico 14C-GA9. Esto sugiere que las oxidasas de GAs presentan eficiencias reducidas en F. konzum lo que se confirmó determinando en los cultivos las velocidades de las reacciones respectivas. Se encontró que en la cepa I3 de F. konzum la GA14 sintasa oxida al ácido ent-14C-kaurenoico con una velocidad 397 veces menor que en la cepa ACC917 de F. fujikuroi mientras que la C20 oxidasa metaboliza el 14C-GA12 con una velocidad reducida en un factor de 216. La reacción final de la secuencia, la 13-hidroxilación, es la etapa limitante de la biosíntesis de GA1 y presentó en F. konzum, una velocidad 48 veces menor que en F. fujikuroi. Utilizando fracciones microsomales obtenidas del micelio de la cepa I3 de F. konzum se demostró que la fuente de electrones para las reacciones de hidroxilación en 3b y oxidación en C7 del GA12 aldehído es exclusivamente el NADPH, lo que sugiere que la citocromo P450 reductasa sería la proteína transportadora de electrones asociada a la GA14 sintasa en este organismo y probablemente también estaría asociada a las demás monooxigenasas de GAs. Tanto la C20 oxidasa como la 13-hidroxilasa de F. konzum presentaron eficiencias similares en presencia y en ausencia de NH4NO3 lo que sugiere que en esta especie de Fusarium el mecanismo de regulación por nitrógeno descrito en F. fujikuroi no es funcional o presenta una baja eficiencia. Esto generaría una baja expresión de los genes de la biosíntesis de GAs explicando la velocidad reducida de las reacciones estudiadas. La secuencia de biosíntesis de giberelinas desde el ácido ent-kaurenoico hasta GA1 y GA3 en F. konzum es similar a la de F. fujikuroi pero ambos sistemas difieren en la eficiencia de las oxidasas y en el mecanismo de inducción lo que explicaría la generación de distintos productos finales y la acumulación de intermediarios en F. konzum

The filamentous fungus Fusarium konzum belongs to the taxonomic complex Gibberella fujikuroi formed by nine biological species isolated from different plants which synthesize various secondary metabolites. Two species of the complex, F. fujikuroi and F. kozum produce gibberellins (GAs), diterpene metabolites active as phytohormones. The other species do not produce GAs even when they contain all or some of the GA-biosynthetic genes. In this work gibberellin biosynthesis was characterized in F. konzum at the level of the chemical reactions as well as of the respective enzymes and was compared to the well known GA-producing species F. fujikuroi. Endogenous GAs analysis indicated that the main product was the 3,13-dihydroxylated lactone GA1. Gibberellic acid (3,13-dihydroxylated, D1,2; GA3) was also found in the cultures although at a lower level. The metabolic sequence for GA1 biosynthesis was determined by adding 14C-labelled precursors into liquid cultures of I3 F. konzum strain which showed that ent-kaurenoic acid, GA12 aldehyde, GA14 (C20) and GA4 (C19) are intermediates of the sequence. The 3b-hydroxylated pathway is the major pathway while the non-hydroxylated is a minor pathway. Hydroxylation at C13 occurs in a late step of the sequence over GA4 or GA7 in contrast to 3b- hydroxylation that occurs over GA12 aldehyde at an early step. In incubations with ent-14C-kaurenoic acid, the 3b-hydroxylated products 14C-GA14 and 14C-GA4 accumulated while the C20 alcohol (14C-GA15) and the C20 aldehyde (14C-GA24) were formed from 14C-GA12 besides the lactonic product 14CGA9. This result suggests that GA oxidases would have reduced catalytic efficiencies in F. konzum which was confirmed by determining the rates of the respective reactions in cultures of the strain I3. In this strain GA14 synthase oxidized ent-14C-kaurenoic acid with a rate 397 times lower than in F. fujikuroi (ACC917 strain) while C20 oxidase metabolized 14C-GA12 with a rate reduced by a factor of 216. The last reaction of the sequence, 13-hydroxylation is the limiting step of GA biosynthesis and showed in F. konzum a rate 48 times lower than in F. fujikuroi. Microsomal fractions obtained from the mycelia of F. konzum catalyzed 3b- hydroxylation and C7-oxidation of GA12 aldehyde exclusively in the presence of NADPH. This suggests that cytochorome P450 reductase would be the electron transport protein associated to GA14 synthase and probably to the other GA monooxygenases in this Fusarium species. Gibberellin C20 oxidase as well as 13- hydroxylase have similar catalytic efficiencies in cultures containing ammonium nitrate or without this compound which suggests that nitrogen regulation of GA biosynthesis is not functional in F. konzum or has a low efficiency. This would explain the reduced rates found for the reactions catalyzed by GA monooxygenases in I3. The biosynthetic sequence from ent-kaurenoic acid to GA1 or to GA3 is similar in F. konzum and in F. fujikuroi although both systems differ in the efficiency of the GA oxidases and in the effect ammonium nitrate which would result in different final products in both systems as well as in accumulation of intermediates in F. konzum