Triclosán inhibe la producción de uroquinasa estimulada por TNF-α y H2O2 en fibroblastos gingivales humanos

Abstract

Triclosán es un agente antibacteriano ampliamente utilizado en productos cosméticos y de higiene oral (jabones, desodorantes, dentífricos, colutorios, etc.) como agente desinfectante. Sin embargo, estudios recientes han sugerido que este fármaco podría tener un papel en el control de la inflamación y retrasar el avance de la enfermedad periodontal. La inflamación crónica en esta patología y la destrucción de los tejidos periodontales, pueden estar asociadas a la elevada activación de plasminógeno a plasmina mediada por Uroquinasa (uPA), una serin-proteasa altamente expresada en esta enfermedad, involucrada en la remodelación tisular y activación de diversas otras proteasas que participan en la degradación de la matriz extracelular (MEC). Por otra parte, en la enfermedad periodontal se encuentra una mayor presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS), niveles elevados de metaloproteasas y citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), lo que en conjunto con los demás factores, contribuyen a la destrucción de la MEC. En el presente estudio se estudió la capacidad de Triclosán para interferir la actividad y producción de uPA y ROS en cultivos primarios de fibroblastos gingivales humanos (FGH) estimulados con TNF-α y peróxido de hidrógeno (H2O2), además de determinar la relación entre la actividad y expresión de uPA con la inducción de vías de señalización intracelulares NFkB, JNK y MEK/ERK1/2, la activación de plasminógeno, el estado redox intracelular y la modulación de estas por Triclosán. Las células fueron estimuladas con TNF-α y Terbutil Peróxido (t-BOOH) un análogo orgánico de H2O2 de mayor estabilidad y con capacidad de penetrar membranas celulares. Se utilizaron distintos inhibidores específicos para las diferentes rutas; de la actividad de MAPquinasas se utilizó PD98095, inhibidor selectivo de MEK1 y SP600125, inhibidor selectivo de JNK. Para inhibir la activación de la vía NF-kB se ocupó el péptido SN50 y su péptido control SN50M. Además de utilizó el inhibidor de la enzima productora del radical superóxido NADH/NAD(P)H oxidasa (DPI), el antioxidante intracelular y precursor de glutatión (NAC), la enzima convertidora de H2O2 catalasa y por último Triclosán, con el fin de interferir la actividad y producción de uPA. Esta fue analizada por zimografía y Western-blot respectivamente. La expresión del ARNm de uPA fue evaluada a través de RT-PCR. La activación de las vías de señalización intracelulares JNK y ERK-1/2 fueron analizadas por Western-blot. La activación de NF- B fue analizada por inmunofluorescencia. Se evaluó la producción intracelular de ROS utilizando el fluoróforo DCHF-DA. Se comprobó que TNF-α es un fuerte estímulo para la producción y actividad de uPA. Triclosán disminuyó la actividad de esta (de forma dosis dependiente) y su expresión (ARNm y proteína), además de inhibir la conversión de plasminógeno a plasmina estimuladas por TNF-α. Se observó también que la actividad de uPA estimulada con esta citoquina es dependiente de las rutas de señalización asociadas a NF-kB y JNK. TNF-α indujo la fosforilación de JNK y producción del factor de transcripción río debajo de JNK c-Jun, las cuales fueron inhibidas por Triclosán, sin embargo no se observaron cambios en la activación de la vía NF-kB. Además, NAC, DPI y catalasa inhibieron la actividad y producción de uPA estimulada por TNF-α. El pro-oxidante t-BOOH indujo la actividad y producción de uPA de forma dosis dependiente y activó la vía ERK-1/2. Triclosán y el inhibidor de ERK-1/2 PD98059 inhibieron la producción y activación de uPA estimuladas con t−BOOH. Se observó que Triclosán posee la capacidad de inhibir la activación de la vía ERK-1/2 estimulada por t BOOH, además de reducir los niveles de ROS intracelulares estimulados con TNF-α, de forma similar que NAC y DPI. Estos resultados sugieren que Triclosán puede tener un efecto protector en la enfermedad periodontal al disminuir la inflamación y destrucción tisular asociados a la actividad de uPA y producción de ROS con la consiguiente remodelación del tejido conectivo gingival. Se sugiere entonces que Triclosán posee una actividad antioxidante intracelular no descrita antes en la literatura, lo que junto con lo anterior podría explicar en parte su efecto protector previamente reportado en estudios clínicos, y sugiere que estos pueden ser aspectos adicionales de su efecto clínico en la destrucción periodontal

Triclosan is an antimicrobial agent highly used in cosmetic and hygiene products (soaps, deodorants, toothpastes, mouth-washes, etc). Recent studies have suggested that Triclosan could have an important role in controlling inflammation and retarding periodontal disease. Chronic inflamation ocurring in this pathology and periodontal tissue destruction, can be associated with an elevated plasminogen activation mediated by urokinase (uPA), a serine-protease highly expressed in this pathology involved in tissue remodeling and activation of diverse extracellular matrix metalloproteinases (MMPs). On the other hand, there is an elevated concentration of reactive oxygen species (ROS) and proinflammatory cytokines like tumor necrotic factor alpha (TNF- a) that contribute to periodontal tissue and extracellular matrix (ECM) destruction. In the present study we evaluated if Triclosan’s capacity interferes with the activation and expression of uPA and ROS in primary cultures of human gingival fibroblasts (HGF) stimulated with TNF-a and hydrogen peroxide (H2O2). The activity and expression of uPA were determined, the relation with intracellular transduction pathways NFkB, JNK and MEK/ERK1/2, plasminogen activation, intracellular redox status and the modulation of these by Triclosan were explored. HGF were stimulated with TNF-a and Tertbutyl Peroxide (1,1-Dimethylethyl hydroperoxide, t-BOOH), an organic analogue of H2O2 that is very stable and crosses cellular membranes. Different kinds of specific inhibitors were used: MAPK activity (Mek1 inhibitor PD98095 and JNK inhibitor SP600125), NF- B inhibitor (SN50), superoxide producing enzyme NADH/NAD(P)H inhibitor (DPI), glutathion precursor and intracellular antioxidant (NAC), H2O2 converting enzyme (Catalase) and Triclosan in order to interfere with uPA’s activity and expression. These were analized through casein zymography and Western-blot, respectively. Expression of uPA was analyzed using RT-PCR. Activation of the signal transduction pathways JNK and ERK-1/2 was analyzed with Western-blot, and NF- B activation through immunofluorescence. ROS production was evaluated utilizing the fluorophore DCHF-DA. We proved that TNF-a is a strong stimuli for uPA activity and production and that Triclosan inhibits this response in a dosis-dependant manner. Triclosan also inhibited uPA’s RNA expression and diminished plasminogen activation to plasmin stimulated with TNF-a. It was also observed that uPA’s stimulation is dependent on the activation of NF- B and JNK transduction pathways. TNF-a induced JNK’s phosphorylation and c-JUN transcription factor, and both were inhibited by Triclosan. There was no change on NF- B activation. Moreover, NAC, DPI and catalase inhibited uPA’s activation and production stimulated by TNF-a. Pro-oxidant t-BOOH induced uPA’s activation and expression in a dose dependant manner and activated ERK-1/2 signal transduction pathway. Triclosan and PD98059 inhibited t-BOOH stimulated uPA activation and production. Triclosan inhibited t-BOOH stimulated ERK-1/2 activation and reduced intracellular ROS levels stimulated by TNF-a, in a similar way to NAC and DPI. These results suggest that Triclosan can have a protector effect on periodontal disease by inhibiting inflammation and tissular destruction associated with uPA activity and ROS production with connective tissue associated remodeling. We suggest that Triclosan possesses a novel intracellular antioxidant activity that could explain in part its protective effect previously reported in clinical studies and suggests that this could be an additional aspect of its clinical effect on periodontal tissue destruction.