Proliferación celular y desarrollo de asimetrías cerebrales en medaka (Oryzias latipes) y pez cebra (Danio rerio)

Abstract

La presencia de asimetrías neuroanatómicas y funcionales en el cerebro de vertebrados es un rasgo ampliamente conservado que juega un papel importante en el comportamiento animal. El desarrollo diferencial de las mitades izquierda y derecha del cerebro se observa desde estados tempranos de la embriogénesis, lo que sugiere una regulación genética. Se ha descrito que la vía de señalización comandada por el factor de crecimiento TGFβ Nodal está involucrada en el establecimiento de asimetría de órganos internos en vertebrados. En pez cebra y medaka, los genes efectores de la vía Nodal, como el factor de transcripción pitx2c, se expresan en forma asimétrica a la izquierda del cerebro, precediendo el desarrollo de asimetrías neuroanatómicas. En pez cebra estas asimetrías incluyen al núcleo habenular y al complejo pineal. Al respecto, se sabe que el núcleo habenular izquierdo es más grande que el núcleo habenular derecho y que el órgano parapineal se localiza en la izquierda del diencéfalo. Estudios preliminares indican que el pez teleósteo medaka presenta un desarrollo de asimetrías neuroanatómicas similares a aquellas del pez cebra. De esta forma pez cebra y medaka son herramientas genéticas que nos permitirán comenzar a descifrar los mecanismos del desarrollo que participan en el establecimiento de las asimetrías neuroanatómicas en vertebrados. El objetivo de esta tesis fue determinar si las asimetrías neuroanatómicas de pez cebra y medaka se correlacionan con diferencias en la tasa de proliferación celular entre las habénulas izquierda y derecha, y si estas diferencias podrían estar controladas por el factor de transcripción pitx2c. Para el primer objetivo se realizaron experimentos de inmunoflurorescencia indirecta contra histona H3 fosforilada. Para el segundo objetivo, se midió la expresión de pitx2c mediante hibridaciones in situ sucesivas. Al respecto, en medaka, el ensayo contra histona H3 fosforilada muestra que existe una diferencia estadísticamente significativa en el número de células en proliferación entre ambas habénulas, a modo que el núcleo izquierdo presenta mayor número de éstas. Los resultados obtenidos sugieren la existencia de una asimetría izquierda/derecha en la tasa de proliferación celular, que es mayor para la mitad izquierda de la habénula. En pez cebra no fue posible realizar este ensayo, debido a que no se logró encontrar un marcador habenular que delimitara esta región en el embrión completo. En esta búsqueda se logró identificar un gen denominado cxcr4b, como un marcador de la zona más anterior de la habénula, donde su expresión muestra una clara tendencia a la asimetría. Por otro lado, se observó que tanto en pez cebra y en medaka, pitx2c se expresa unilateralmente en el epitálamo, específicamente en el lado izquierdo, desde estadios muy tempranos del desarrollo hasta estadios tardíos. La expresión más tardía no había sido descrita y está a favor de un posible papel de pitx2c en la morfogénesis asimétrica cerebral. Finalmente, se pudo establecer una correlación espacial y temporal entre la expresión de pitx2c y las asimetrías en la proliferación celular en la habénula de medaka, ya que los precursores habenulares izquierdos expresan pitx2c en el momento donde se observan las asimetrías en proliferación celular. Estos hallazgos deben ser en el futuro corroborados con experimentos de ganancia y pérdida de función de pitx2c

Neuroanatomical and functional asymmetries of the brain are conserved among vertebrates and play important roles in animal behaviour. Differences between the right and left sides of the brain have been described at early developmental stages, suggesting a genetic regulation of asymmetry. The Nodal pathway is one of many signalling pathways involved in the establishment of organ asymmetry in vertebrates. In zebrafish and medaka, effectors of the Nodal signaling pathway, such as the transcription factor pitx2c, are asymmetrically expressed in the left side of the brain, preceding the development of neuroanatomical asymmetries. Genetic studies in zebrafish have reported asymmetries within the epitalamic habenular nuclei and pineal complex. It is known that the left habenular nucleus is larger than the right nucleus, and that the parapineal organ is located on the left side of the diencephalon. Preliminary data indicate that medaka, a teleost similar to zebrafish, shows a similar pattern of neuroanatomical asymmetries in the brain. Therefore, zebrafish and medaka have emerged as genetic tools that will facilitate our understanding of the developmental basis of brain asymmetry. The aim of this thesis was to investigate whether the development of neuroanatomical asymmetries is associated with a differential rate of cell proliferation between the left and right habenular nuclei in zebrafish and medaka. In this thesis we also investigated whether differences in cell proliferation correlate with asymmetric expression of the transcription factor pitx2c. The first aim was approached using indirect immunofluorescence against phosphorylated histone H3. For the second aim, the pattern of expression of pitx2 was determined through in situ hibridization. The antibody essay against phosphorylated histone H3 in medaka revealed a difference in the number of proliferating cells within the habenulae, the left nucleus showing a larger amount of proliferating cells. These results suggest an asymmetric pattern of cell proliferation, in favor of the left habenular nucleus. It was not possible to perform the same assay in zebrafish due to the lack of an habenular marker that would allow us to circumscribe this region in the whole embryo. In this research, we were able to identify cxcr4b as a marker of the anterior habenular region, where its expression was clearly asymmetric. pitx2c was expressed unilaterally in the left epitalamic region of zebrafish and medaka, from early to late developmental stages. The late expression of pitx2c, which was not described before, supports a possible role of pitx2c during asymmetric morphogenesis of the brain. Finally, a spatial and temporal correlation was established between pitx2c expression and asymmetries in cellular proliferation in the habenulae of medaka. Precursors of the left habenular nucleus express pitx2c at the same time when asymmetries in cell proliferation are observed. These findings must be investigated further using pitx2c gain and loss of function experiments