Ensayos cromatográficos para la determinación de glibenclamida en plasma humano

Abstract

La Glibenclamida es una potente sulfonilurea de segunda generación, bastante eficaz para el tratamiento de la Diabetes mellitus tipo 2, patología de alta incidencia en la población [1]. Este trabajo postuló a la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detección fluorométrica como un método idóneo para la determinación y cuantificación de Glibenclamida en plasma usando Ketoconazol como estándar interno [2]. Las condiciones cromatográficas empleadas fueron: una columna C8 de 5μm en tamaño de partícula, una fase móvil compuesta de un buffer (NH4)H2PO4 0,05 M pH 5,7 y acetonitrilo 55/45, un flujo de 1 mL/min y un detector fluorométrico configurado con un λ de excitación de 235 y un λ de emisión de 354 [2]. Con este esquema se realizaron los primeros ensayos para ver si el sistema cromatográfico y el detector propuestos eran idóneos para el desarrollo de este estudio. Los primeros ensayos sobre soluciones estándares de Glibenclamida exhibieron buenos resultados en parámetros como sensibilidad (límite de cuantificación = 10 ng/mL) y linealidad (r = 0,9998) en la respuesta del equipo, además de determinar que las soluciones de Glibenclamida presentaban una alta estabilidad (más de un mes) Posteriormente se midieron muestras plasmáticas de Glibenclamida, observándose que el método propuesto era capaz de identificar y cuantificar al analito inmerso en su matriz, pero con el detalle de arrojar bajos valores en la recuperación de éste. Se caracterizó y desarrolló un método de extracción de los analitos (Glibenclamida y Ketoconazol) desde su matriz, que consistió en realizar una precipitación de proteínas plasmáticas utilizando Acetonitrilo y sulfato de cobre como agentes precipitantes [2]. Método que arrojó los valores más satisfactorios en cuanto a recuperación (84% para Glibenclamida y 70% para Ketoconazol) con respecto a los métodos ensayados en las primeras etapas de este estudio, extracción en fase sólida (SPE) y extracción líquido-líquido [3-6]. Por último, tras experimentar la descompostura del detector fluorométrico utilizado en las mediciones, se intentó acoplar el sistema HPLC ya establecido a un detector ultravioleta, lo que resultó ser insatisfactorio debido a la baja sensibilidad que presenta este tipo de detector (límite de cuantificación = 40 ng /mL) para la medición de Glibenclamida en las concentraciones establecidas para el estudio [4].

Glyburide is a potent sulphonylurea from second generation quite effective for the treatment of type 2 diabetes mellitus, disease of high incidence in the population [1]. This study postulated to High Performance Liquid Chromatography (HPLC) with fluorescence detection, as a suitable method for the determination and quantitation of Glyburide in plasma using Ketoconazole as internal standard [2]. The used chromatographic conditions were: a scanning fluorescence detector with excitation and emission wavelengths set at 235nm and 354nm respectively, a C8 column packed with 5μm particle size, and a mobile phase consisted of 55% buffer solution ( 0,05M (NH4)H2PO4 pH 5,7) and 45% of acetonitrile, pumped at 1mL/min flow rate [2]. With these conditions the first tests were made to see if the proposed chromatographic system was suitable for the development of this study. The tests on standard solutions of Glyburide showed good results in parameters like sensitivity (LOQ = 10ng/mL) and linearity (r = 0,9998). Beside to determine that the solutions of Glyburide displayed a high stability ( more of a month ). Later, plasma samples of Glyburide were measured, being observed that the proposed method was able to identify and quantify the drug immersed in its biological matrix, but the problem was the low values obtained in the recovery of Glyburide. A method of extraction of drugs (Glyburide and Ketoconazole) from its matrix was characterized and developed, that consisted of making a plasma protein precipitation using acetonitrile and copper sulphate as precipitant agents [2]. This method obtained the most satisfactory values in recovery of drugs (Glyburide: 84% and Ketoconazole: 70%) respect to methods tried in the first stages of this study: Solid-Phase Extraction (SPE) and liquid-liquid extraction [3-6]. Finally, after undergoing the breakdown of the used fluorescence detector in the measurements, it was tried to connect the HPLC system already established to an UV-detector, wich turned out to be unsatisfactory due to its low sensitivity ( LOQ = 40ng/mL ) for the measurement of Glyburide at the concentrations established for the study [4].