Estudio de la Destinación Intracelular de la Polifenol Oxidasa de Chirimoya (Annona Cherimola) Mediante la Expresión Transitoria de Construcciones Quiméricas con la Proteína Verde Fluorescente

Abstract

La chirimoya (Annona cherimola Mill.) es uno de los candidatos más atractivos para su procesamiento por corte fresco en la nueva industria alimenticia. Sin embargo, este fruto presenta una marcada tendencia al pardeamiento, proceso en el que se ha descrito estar involucrada la enzima polifenol oxidasa (PPO). Resultados recientes nos han permitido definir la secuencia génica completa responsable de la síntesis de PPO en chirimoyas (Acppo). La proteína deducida desde esta secuencia (AcPPO) presentó dos codones de inicio candidatos (ATG), lo que llevó a un complejo análisis bioinformático sobre el significado de los aminoácidos encontrados en el extremo N-terminal de la proteína predicha. En este trabajo, se describe un análisis funcional detallado de las secuencias N-terminal de AcPPO y su importancia en los eventos post-traduccionales relacionados a la destinación sub-celular final de la proteína propuesta. Se fusionaron al gen reportero GFP, las dos zonas candidatas a señal (definidas por estas metioninas) encontradas en el extremo N-terminal de AcPPO, junto con la secuencia completa y los respectivos controles. Las construcciones desarrolladas se evaluaron por transformación vía Agrobacterium tumefaciens e infiltración de plantas de Nicotiana tabacum, para evaluar la emisión de fluorescencia debido a GFP a través de microscopía confocal. Los resultados indicaron que, efectivamente, el péptido definido como N-terminal de AcPPO posee la propiedad de dirigir GFP (y por lo tanto PPO) hacia cloroplastos, determinándose la existencia de una secuencia mínima necesaria para que esto ocurra (péptido CLORO). Esto demuestra experimentalmente, la idea previa de que AcPPO es destinada hacia cloroplasto

Cherimoya (Annona cherimola Mill.) fruit is an attractive candidate for food processing applications as fresh cut. However, it has a marked susceptibility to browning and this condition is mainly attributed to polyphenol oxidase activity (PPO). Recent work has allowed us the cloning, sequencing and experimental analysis of the full length Acppo gene. The predicted protein (AcPPO) presented two candidates ATG starting codons, generating a complex N-terminal analysis about the real compartmentalization of the enzyme by simple bionformatic processing of the sequences. A detailed functional analysis of the post-translational events involved in the final AcPPO sorting and cell distribution, was carried out by fusion of the two putative N-terminal signals found in AcPPO, to the green fluorescent protein (GFP) gene. Constructs either with the full-length (first ATG) or the second-half (second ATG) segment of the N-terminal peptide, were separately studied in transient expression assays. Agrobacterium tumefaciens infections with clones harboring these constructs on Nicotiana tabacum leaves were then evaluated by confocal microscopy. The existence of a minimal sequence in this N-terminal segment of the gene needed to direct AcPPO into chloroplasts was well established, supporting the idea that the cloned gene generates a protein that is sorted into these organelles