| Abstract | dc.description.abstract | El canal de calcio/receptor de ryanodina permite que el calcio contenido en el retículo
sarcoplasmático (RS) sea liberado hacia el mioplasma. Múltiples componentes celulares regulan
la actividad de este canal de calcio, entre los que se distinguen: Ca
2+
, Mg
2+
, H
+
, ATP
2-
, calcio
luminal, agentes que reaccionan con grupos SH, entre otros. Por otra parte, existen evidencias
que sugieren que calsecuestrina, una proteína del lumen del RS, estaría regulando la cinética de
liberación de calcio. Originalmente, a esta proteína se le atribuyó un papel de tampón de calcio,
lo que permite acumular grandes cantidades de este ion al interior del RS. Es importante
establecer la cinética de disociación del calcio desde la calsecuestrina para investigar si es una
etapa limitante de la liberación de calcio.
En esta tesis se caracterizó la participación de Mg
2+
, de calsecuestrina y del estado redox de
proteínas, en la cinética de liberación de calcio inducida por cafeína. Se utilizó una preparación
de vesículas aisladas de RS de músculo esquelético de conejo y se midió la liberación de calcio
siguiendo la señal de indicadores fluorescentes de calcio. Cafeína indujo liberación transitoria y
parcial de calcio en el intervalo de [Mg
2+
] libre 0,05 - 2,5 mM. En vesículas nativas, en [Mg
2+
]
0,1 - 0,5 mM este primer evento de liberación fue seguido por oscilaciones de calcio. En
ausencia de cafeína se observaron oscilaciones espontáneas de calcio. La magnitud y la duración
del primer evento de liberación inducido por cafeína disminuyeron con el aumento de [Mg
2+
].
Al oxidar las vesículas, aumentó la duración del primer evento de liberación en todas las
concentraciones de Mg
2+
probadas. Lo inverso ocurrió al reducir las vesículas. El patrón
oscilatorio también se modificó al tratar las vesículas con los reactivos redox. Se sabe que estos
reactivos modifican la afinidad del sitio inhibitorio para Mg
2+
. Estos resultados indican que las
vesículas de RS poseen todos los elementos requeridos para la generación de oscilaciones de
calcio, que previamente habían sido observadas sólo en células y en fibras musculares. Además,
los resultados indican que la liberación de calcio inducida por cafeína está directamente regulada
por [Mg
2+
] libre y que al modificar el(los) sitio(s) inhibitorio(s) para Mg
2+
, cambia
marcadamente la respuesta a cafeína.
En vesículas sin calsecuestrina disminuyó la cantidad de calcio acumulada tanto en forma
pasiva como en forma activa. El calcio acumulado fue liberable por agonistas del canal de
ryanodina. La liberación de calcio presentó una constante de velocidad de liberación menor que
en vesículas control. También se redujo la duración de la liberación neta de calcio. No se
observaron oscilaciones de calcio en vesículas sin calsecuestrina. Esta proteína fue fundamental
no sólo para que las vesículas acumularan grandes cantidades de calcio sino que también para su
posterior liberación con una cinética rápida acorde con las exigencias del músculo esquelético.
Estudios cinéticos de la disociación del calcio unido a calsecuestrina indican que la
disociación del calcio desde calsecuestrina en solución o asociada a membranas fue más rápida
que los cambios de fluorescencia intrínseca asociados. Se utilizó una preparación de membranas
de la zona de unión del RS al túbulo transversal. Estas membranas son denominadas JFM, del
inglés
j unctional
f ace
m embranes
. En las JFM, la disociación de calcio y el cambio de
fluorescencia intrínseca fueron más rápidos que en calsecuestrina en solución. El t
1/2
de la
disociación de calcio en JFM fue de 6,5 mseg a 25 #C. Es probable que a 37 #C, la disociación
de calcio sea aun más rápida. Estos resultados sugieren que la disociación de calcio desde
calsecuestrina
in vivo
no es limitante de la velocidad de liberación de calcio desde el RS. | |
