Función de las Metalotioneínas en el metabolismo celular de cobre

Abstract

Copper is an essential micronutrient for life, it is required by a wide range of species, from bacteria to yeast, plant and humans. Copper essentiality is based in the capacity of the metal to be an intermediary in the transfer of electrons; thus, redox active enzymes that participate in physiological process like cellular respiration, iron transport and metabolism, and neurotransmitter synthesis utilize it. On the other hand, as a consequence of its redox properties, copper is potentially toxic to membranes, DNA and proteins through a Fenton´s type reaction. To prevent excess or deficit, living organisms have developed mechanisms that regulate copper in plasma and tissue stores, through specialized tissues such as intestinal mucosa and hepatic tissue. A number of molecules at a cellular level regulate the uptake, efflux, storage and utilization of the metal. The evidence indicates that copper handling is tightly regulated, thus, under normal conditions it is almost impossible to find a free copper ion inside the cell. Metallothioneins (MTs) are proteins involved in the regulation of intracellular copper metabolism. MTs are found in all eukaryots as well as some prokaryots; the structure is highly conserved across species. Physical-chemical properties allow MTs to coordinate the binding of multiple atoms of copper with a high affinity, and at the same time since these are kinetically labile they can be transferred to other molecules. Copper induces MT expression, thus intracellular MT content is related to an increase in cell resistance to copper toxicity. These properties suggest that MTs have an important role in cellular copper metabolism, storage and/or delivery of copper ions to specific cupro-enzymes. Since the role of MT has not been fully characterized, the goal of this doctoral thesis was to evaluate MT function in copper metabolism of cells maintained in sub, iso- and supra- physiological concentrations of copper. The results of this thesis indicate that in the absence of MT, cultured cell grown in low and normal concentration of copper have a decreased capacity to store copper; moreover they are more sensitive to an increment in intracellular copper, decreasing their viability. The increment in intracellular copper relative to wild cells is not explained by an increase in copper uptake, suggesting a difference in the efflux rate. The analysis of efflux of newly incorporated copper showed that in absence of MT, the retention of this copper is slightly lower; this may explain in part, the lower copper content observed in these cells. Finally, I have demonstrated that in the absence of MTs, the capacity of copper to induce gene expression of MT, SOD1 and Ccs1 its chaperone is lost. This observation could partially explain the increased vulnerability of MT null cells to lower intracellular copper concentrations. I propose as conclusions of this thesis that the presence of MT is important to maintain an appropriate regulation of intracellular copper homeostasis in cells grown at physiological copper concentrations and especially in response to extracellular copper excess. This response is dependent on the capacity of MT to store copper under physiological conditions and in response to excess, sequester intracellular copper in a safe form.

El Cu es un micro nutriente esencial para el desarrollo de la vida de organismos tan diversos como bacterias, levaduras, plantas y mamíferos, incluyendo al hombre. La esencialidad de este metal se deriva de su capacidad de ser un intermediario en la transferencia de electrones, por lo que es utilizado por diversas enzimas con actividad redox que participan en procesos fisiológicos como la respiración celular, el metabolismo y transporte de hierro a través de membranas y la síntesis de neurotransmisores. Por otro lado, en consecuencia de esta propiedad redox, el Cu es un elemento potencialmente tóxico, dado que puede generar, por reacciones de tipo Fenton, daño celular a membranas, DNA y proteínas. Para evitar tanto el déficit como el exceso, los organismos han generado mecanismos que regulan el nivel de Cu circulante y las reservas, a través de la especialización de tejidos como la mucosa intestinal e hígado. En las células, existen diversas moléculas involucradas en la homeostasis de Cu, las que regulan la entrada, la salida, el almacenamiento y la utilización intracelular del metal. Las evidencias indican que el manejo del Cu está finamente regulado, de forma tal, que en condiciones normales la probabilidad de encontrar un ión de Cu libre dentro de la célula es casi nula. Las metalotioneínas (MTs) son proteínas claves involucradas en el manejo intracelular del Cu. Éstas se expresan tanto en procariontes como eucariontes, y su estructura es altamente conservada. Sus propiedades fisicoquímicas le permiten coordinar la unión de múltiples átomos de Cu con una alta afinidad y, al mismo tiempo, tener la labilidad cinética necesaria para entregar alguno de ellos. La expresión de MT es inducida por Cu, y su expresión se relaciona con un aumento en la resistencia frente a la toxicidad generada por el metal. Estas propiedades sugieren que MT tiene un papel importante en el manejo intracelular de Cu a través del almacenamiento y/o la transferencia del metal a metaloproteínas específicas. Dado que su papel en el metabolismo celular de Cu no ha sido completamente establecido, el objetivo de esta tesis doctoral fue evaluar su función en el metabolismo celular de Cu en células mantenidas a concentraciones sub-, iso- y supra-fisiológicas del metal. Los resultados de esta tesis indican que, en ausencia de MT, las células en cultivo mantenidas a una concentración iso- y supra-fisiológica de Cu, tienen una capacidad disminuida de almacenar el metal. A pesar de su menor contenido, las células que carecen de MT son más sensibles a un aumento en el contenido interno de Cu, disminuyendo su viabilidad frente a la exposición al metal. La diferencia en el contenido intracelular, respecto a las células silvestres, no es explicada por un cambio en la tasa de incorporación, sugiriendo que debe haber una disminución en la tasa de salida. El análisis de la excreción de la población de Cu recién incorporado indica que en ausencia de MT, la retención de esta población de Cu es levemente menor, lo que en condiciones de exposición prolongada, podría explicar, al menos en parte, el menor contenido de Cu en las células que no expresan MT. Finalmente, se observó que, en ausencia de MT, se altera la inducción por Cu de la expresión de MT, SOD1 y su chaperona Ccs1. Esto podría explicar en parte, la mayor sensibilidad de células nulas a un menor contenido intracelular del metal. Como conclusiones de esta tesis, propongo que la presencia de MT es importante para mantener una apropiada regulación homeostática del Cu intracelular, en las células mantenidas a una concentración fisiológica y especialmente en respuesta a un exceso de Cu extracelular. Dicha respuesta depende de la capacidad de MT de almacenar Cu en forma fisiológica, y frente al exceso secuestrar el Cu intracelular en forma segura.