Clonamiento, expresión y caracterización de las subisoformas de la Proteínaquinasa CK1a de Pez cebra (Danio rerio)

Abstract

La proteínaquinasa CK1 es una enzima altamente ubícua y conservada en todos los eucariontes estudiados y, particularmente, dentro de los vertebrados. En estos organismos, la enzima existe como una familia de siete miembros genéticamente distintos, denominados CK1#, #, #1, #2, #3, # y #. Hasta el momento se ha determinado que los mensajeros de tres de estas isoformas, #, #1 y #3, sufren procesamiento alternativo, dando lugar así a nuevas variantes. En particular, el mRNA de la isoforma a da origen a 4 subisoformas, definidas por la presencia o ausencia de 2 segmentos adicionales, llamados inserto L e inserto S. El primero se ubica en medio del dominio catalítico de la enzima, en la llamada region “bisagra” y el segundo se encuentra localizado en el extremo C-terminal. La coexistencia de algunas o todas estas variantes se ha descrito anteriormente en rata, pollo y humano y las secuencias de los insertos se encuentran altamente conservadas entre estas especies. En esta Tesis, se clonaron las cuatro variantes de procesamiento de CK1# de pez cebra ( Danio rerio ) y se expresaron tanto en células de E. coli como en células eucarióticas en cultivo. La caracterización bioquímica de las variantes recombinantes expresadas en bacterias determinaron que las que contienen el inserto L tienen una menor afinidad por ATP, al igual que por el inhibidor específico, CKI-7, que compite por el sitio de unión del nucleótido. Estas variantes, además, muestran una mayor actividad hacia #-caseína, aunque no existen diferencias en el valor de la Km aparente entre las cuatro isoformas con respecto a los sustratos proteicos y peptídicos ensayados, #-caseína, fosvitina y el péptido RRKDLHDDEEDEAM SITA, derivado del inhibidor-2 de la proteína fosfatasa 1 (PPI2). Las variantes L también exhiben una mayor termolabilidad a 40°C, comparadas con las que no contienen este inserto. Esta secuencia contiene además un sitio canónico para la fosforilación por PKA y, al ser incubadas con esta enzima, la fosforilación es estimulada en 2 veces para CK1#, 6 veces para #S, 16 veces para #L y aproximadamente 70 veces para #LS. Esto sugiere que la PKA fosforila a CK1#, en particular dentro de los insertos y especialmente el inserto L. Por otro lado, las cuatro variantes poseían actividad autofosforilativa y tirosinaquinasa. Otro aspecto abordado en esta Tesis fue la fosforilación de NFAT4 por CK1. El trabajo de Zhu y col. (1998) demuestra que este factor de transcripción es fosforilado in vivo por CK1# y que esta fosforilación previene la entrada de NFAT4 al núcleo. En esta publicación se describe un putativo sitio de acoplamiento o “docking” dentro de la secuencia donde interactúa CK1. En nuestro estudio se utilizaron péptidos sintéticos que abarcaban las regiones conservadas A y Z y la región “linker” entre ellas (L). Tanto las variantes de CK1a de pez cebra como CK1 nativa purificada de hígado de rata fosforilaban residuos no canónicos contenidos en la región A2, pero no la Z, a diferencia de lo encontrado por Zhu y col. (1998). Una extensión de residuos acídicos presentes en la región L demostró ser esencial para la fosforilación eficiente del dominio A2, como se pudo determinar por un aumento en la Km de un orden de magnitud provocada por la deleción de la región L o por la sustitución de los residuos acídicos por glicinas o alaninas. Este resultado también difiere de los de Zhu y col., que habían ubicado el sitio “docking” en la región A2. Por otro lado, al reemplazar una de las serinas del extremo N-terminal de la región A2, la Ser177, por fosfoserina, se desencadena un efecto jerárquico que provoca un aumento dramático en la eficiencia de fosforilación del péptido. Estos datos son consistentes con un mecanismo bifásico de fosforilación, en que la región L provee un sitio “docking” funcional que facilita la fosforilación no canónica de la Ser177, la que, consiguientemente, gatilla una cadena de fosforilaciones jerárquicas río debajo de este residuo. Con objeto de realizar estudios sobre el comportamiento in vivo de las variantes de CK1#, se transfectaron células Cos-7 con construcciones de CK1# y CK1#L. Mediante inmunocitoquímica, se determinó que la CK1# se localizaba en forma generalizada dentro de la célula, predominantemente en el citoplasma. CK1#L, en contraste, se localizaba en forma predominante en el núcleo, lo que sugiere que la secuencia PVGKRKR, contenida dentro del inserto L, constituiría una señal de localización nuclear funcional. La variante más larga también exhibió una vida media 4 veces menor que CK1#, siendo de 97 y 400 minutos, respectivamente, como fue determinado por experimentos de pulso y caza en células transfectadas y marcadas metabólicamente con 35 S. Mediante experimentos de RT-PCR utilizando RNA total de embriones y adultos de pez cebra, se determinó que la proporción relativa de los transcritos de las cuatro subisoformas varía a lo largo del desarrollo y en adulto, observándose un aumento relativo de #S y una caída en el nivel de #L entre los estadíos de 1 célula y larva (4-5 días). Además, por hibridación in situ utilizando una sonda general para las cuatro variantes de CK1#, se observó una expresión generalizada de los mensajeros de esta isoforma de CK1 hasta las 24 h de desarrollo y, entre los 2 y 3 días, una localización más específica en la cabeza y el primordio de la aleta pectoral. En síntesis, la presencia del inserto L confiere a la enzima algunas propiedades que la distinguen de las variantes que no contienen este inserto: Altera el sitio de unión a ATP, disminuyendo levemente la afinidad por el nucleótido, disminuye la estabilidad de la enzima, tanto in vivo como in vitro frente a una temperatura de 40°C, aumenta el nivel de fosforilación de la CK1# en presencia de PKA y concentra la enzima en el núcleo, probablemente debido a la secuencia PVGKRKR contenida en el inserto L.