Evaluación de la disrupción endocrina y efectos toxicológicos en Daphnia magna de un extracto estandarizado de Buddleja globosa Hope y de su componente mayoritario

Abstract

La planta Matico, Buddleja globosa Hope, Budlejaceae es una especie nativa en Chile de la cual se usan sus hojas por sus múltiples propiedades terapéuticas. Las investigaciones más recientes han permitido demostrar que el extracto etanólico (EMATst) obtenido a partir de sus hojas y estandarizado en su principal componente (verbascósido) presentó efectos antiinflamatorio, analgésico y cicatrizante. Este compuesto ha sido identificado en distintas especies vegetales y se le ha demostrado mediante ensayos in vitro efecto estrogénico y antiestrogénico dependiente de la concentración. En esta tesis se estudió la propiedad estrogénica y el posible efecto disruptor endocrino (DE) del EMATst y del verbascósido usando distintos modelos experimentales tanto in vivo como in vitro. Esta investigación se inició con la recolección de las hojas de matico en el mes de enero de 2008, en el campus Antumapu de la Universidad de Chile, con el objetivo de obtener el EMATst que fue elaborado por extracción sucesiva del material vegetal con solventes de polaridad creciente (hexano, diclorometano y etanol). La cuantificación del componente mayoritario (verbascósido) del extracto etanólico se realizó por CLAE-DAD y se expresó en ácido cafeíco. Posteriormente a partir del EMATst por sucesivas columnas cromatográficas de silicagel 60 y Sephadex LH20, se aisló el verbascósido. Tanto EMATst como verbascósido fueron utilizados para realizar los trabajos experimentales con el fin de determinar la alteración del ciclo estral de ratas de laboratorio despu es de la administración subcutánea de dos diferentes dosis de EMATst; posible unión competitiva de EMATst y verbacósido al receptor estrogénico (RE) mediante un ensayo in vitro usando citosol de útero de rata como fuente de RE; toxicidad aguda de Daphnia magna mediante la determinación de la concentración letal 50 (CL50) a las 24 h de exposición; toxicidad crónica y efecto DE mediante la determinación de la sobrevivencia, frecuencia de muda y reproducción de dos generaciones a los 14 días de exposición. Nuestros resultados permitieron demostrar que el EMATst en dosis alta (10-5 M) provocó una alteración en el ciclo estral de ratas, lo que podrá atribuirse a un efecto antiestrogénico. Tanto EMATst como verbascósido se unieron levemente de modo competitivo al RE comparado con estradiol. Ambos presentaron una baja toxicidad aguda relativa respecto del t oxico de referencia (dicromato de potasio) y 17 ß-estradiol en D. magna. Los resultados de toxicidad crónica en D. magna, muestran que se produce una disminución de la reproducción en ambas generaciones dependiente de la concentración y más marcada aún en la segunda generación y el efecto DE de ambas muestras se manifestó porque se alteró la reproducción

Matico plant, Buddleja globosa Hope, Budlejaceae is a native species in Chile which used their leaves of its multiples therapeutic properties. More recent investigations have demonstrated that the ethanol extract (EMATst) obtained from leaves and with an standardized main component (verbascoside) presented anti-in ammatory, analgesic and scarring e ects. This compound has been identi ed in di erent plant species and has shown through in vitro assays concentration dependent estrogenic and antiestrogenic e ects. In this thesis we studied the estrogenic property and possible endocrine disruptor (ED) e ect of EMATst and verbascoside using di erent experimental models both in vivo and in vitro. This investigation began with collecting matico leaves in the month of January 2008, in the Antumapu campus of the University of Chile, in order to obtain EMATst which was prepared by the successive extraction of plant material with solvents of increasing polarity (hexane, dichloromethane and ethanol). Quanti cation of the major component (verbascoside) of the ethanol extract was performed by HPLC-DAD and expressed as ca eic acid. Subsequently, verbascoside was isolated from EMATst by successive silica gel 60 and Sephadex LH20 chromatographic columns. Both EMATst and verbascoside were used to perform experimental work to determine the alteration of the estrous cycle of rats after subcutaneous administration of two di erent doses of EMATst; verbacoside and EMATst possible competitive binding to the estrogen receptor (ER) though an in vitro assay using the cytosolic fraction of a rat uterus as ER source; acute toxicity of Daphnia magna by determining the lethal concentration 50 (LC50) after 24 hours of exposure; chronic toxicity and DE e ect by determining the survival, molt frequency and reproduction of two generations at 14 days of exposure. Our results show that the EMATst at a high-dose (10-5 M) caused an alteration in