Rol del receptor P2X7 en la respuesta de los astrocitos a Thy-1 en un contexto de inflamación por daño celular

Abstract

Los astrocitos responden a un estímulo inflamatorio modificando su morfología y su patrón de expresión génica y participando en la formación de la cicatriz glial, en el caso de lesión traumática. La cicatriz glial se relaciona con la generación de un ambiente no permisivo para la regeneración axonal, el que contiene además moléculas responsables de la pobre reparación existente en el sistema nervioso central. Entre estas moléculas destacan los proteoglicanos de Condroitin sulfato secretado por los astrocitos que forman la cicatriz glial, la proteína Nogo presente en la membrana de los oligodendrocitos y, muy importantemente para este estudio, la glicoproteína Thy-1, presente en la superficie neuronal. Por muchos años, nuestro laboratorio ha estado enfocado en estudiar las funciones y modo de señalización de Thy-1, proteína anclada por un tallo glicosilfosfatidil inositol a la cara externa de la membrana plasmática. Evidencias indican que Thy-1 participa en la inhibición del crecimiento axonal y en mediar interacciones célula - célula. Hemos mostrado además que el efecto de Thy-1 ocurre por medio de dos receptores, la Integrina αvβ3 y Sindecán-4 presentes en los astrocitos de línea DITNC1. La interacción de Thy-1 con sus receptores por tiempos cortos induce un aumento de la adhesión de los astrocitos, mientras que la estimulación prolongada con Thy-1 induce la migración de estas células. La interacción de Thy-1 con sus receptores induce en los astrocitos la activación de cascadas transduccionales que llevan al aumento en la actividad, temporalmente diferenciado, de las GTPasas RhoA y Rac1 entre otros. Además Thy-1 induce la salida de ATP desde el astrocito que resulta en la activación del receptor P2X7 y la entrada de calcio extracelular. Se sabe que estas señales son necesarias para la adhesión de estas células; sin embargo, ¿Cómo sale el ATP de los astrocitos en respuesta a Thy-1? ¿Se requiere de este ATP extracelular y de la activación del receptor P2X7 para la migración de los astrocitos DITNC1 inducida por Thy-1? Son preguntas que buscamos responder en este trabajo. Por otro lado, resultados de nuestro laboratorio muestran que, contrario a lo encontrado para los astrocitos DITNC1, astrocitos de cultivo primario no responden a Thy-1 y expresan niveles muy bajos de la Integrina β3. Además, se ha descrito que astrocitos primarios aumentan la expresión de esta Integrina en condiciones de daño por derrame cerebral. Dado que los astrocitos sufren cambios morfológicos y migran en condiciones proinflamatorias para reparar el daño, es posible que las diferentes respuestas observadas en los astrocitos primarios y los de línea celular frente al estímulo de Thy-1 se deban a los distintos niveles de integrina expresada por ambos tipo de células. Por lo tanto, en este estudio proponemos que la migración de los astrocitos DITNC1 inducida por Thy-1 requiere de la salida del ATP al espacio extracelular – por mecanismos aún por dilucidar – y de la activación del receptor P2X7. Además, que la baja expresión de la Integrina β3 no permite a los astrocitos de cultivo primario responder a Thy-1. Para estudiar la salida de ATP desde el astrocito y qué vías están involucradas se realizaron mediciones de ATP extracelular por técnicas de luminiscencia, incorporación de sondas fluorescentes a las células, medición de cinéticas de calcio intracelular, entre otras. Para evaluar los requerimientos en la migración inducida por Thy-1 se llevaron a cabo ensayos de cierre de herida y ensayos de polaridad celular. La participación de las distintas moléculas en los mecanismos estudiados se analizó con el uso de inhibidores farmacológicos, bloqueadores de canales o antagonistas de receptores, también se utilizó herramientas de modificación de la expresión génica de las moléculas estudiadas. Para monitorear la respuesta de los astrocitos primarios al estímulo de Thy-1, se realizó cultivos de astrocitos corticales, los que fueron tratados o no con citoquinas proinflamatorias como TNFα. Se analizó cambios de expresión de la Integrina β3 por Western Blot frente a este tratamiento. La respuesta migratoria de los astrocitos tratados con o sin TNFα, frente al estímulo de Thy-1 se realizó por ensayo de cierre de herida en distintas condiciones, como silenciando o sobreexpresando la Integrina β3. Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que Thy-1 induce la salida de ATP, requiriendo la presencia de ambos sitios de interacción con sus receptores. Mutación en el sitio de unión a integrinas anula completamente la respuesta, mientras que la mutación en el sitio de unión a Sindecán-4 disminuye y retrasa la respuesta. Se demuestra en este trabajo que la salida de ATP ocurre a través de los hemicanales Conexina 43 y Panexina 1, abriéndose estos hemicanales por medio de un mecanismo que requiere de aumentos de calcio intracelular proveniente del retículo endoplásmico y que sale al citoplasma a través del receptor de IP3R. La salida de ATP es necesaria para el aumento en el área promedio de la adhesión focal y el aumento en el número de adhesiones focales por célula inducida por estimulaciones cortas con Thy-1. Estimulaciones prolongadas llevan a un aumento en la polaridad celular y en la migración de los astrocitos DITNC1, efecto que también requiere de la apertura de hemicanales, la presencia de ATP extracelular y de la activación del receptor P2X7. La estimulación de los astrocitos con BzATP, agonista del receptor P2X7, a altas concentraciones estimula la migración celular, mientras que bajas concentraciones, por si solas, no provocan este efecto. Sin embargo, nuestros estudios muestran que frente a una estimulación concomitante de Thy-1 mutado en el sitio de unión a Integrina y BzATP a bajas concentraciones es suficiente para inducir la migración de los astrocitos DITNC1 sugiriendo que el aumento extracelular de ATP requiere de la actividad del sitio de unión a Integrina de Thy-1. Estos resultados indican además que la activación del receptor P2X7 por ATP (o BzATP) y la ruta activada río debajo de la interacción de Thy-1 con probablemente Síndecan-4 (Thy-1 mutado en el sitio de unión a Integrina posee sitio de unión a heparina intacto) son necesarias para inducir la migración de los astrocitos. Los astrocitos de cultivo primario cambiaron su fenotipo tras ser expuestos a la citoquina pro-inflamatoria TNFα, aumentando la expresión de las proteínas Integrina β3, GFAP y receptor P2X7, lo que permitió también a los astrocitos migrar en respuesta a Thy-1. Ensayos realizados con astrocitos primarios en que se sobre-expresa o silencia el gen codificante para la Integrina β3, demostraron que la respuesta a Thy-1 luego del tratamiento con agentes pro-inflamatorios, es dependiente de la expresión de dicha Integrina. Se demostró además que la migración de estos astrocitos inducida por Thy-1 también requiere de ATP extracelular y de la activación del receptor P2X7. Estos datos aportan al entendimiento del papel que tienen los astrocitos en el desarrollo de una respuesta inflamatoria tras un daño al sistema nervioso central. Además, aportan antecedentes interesantes sobre cómo una interacción neurona – astrocito, a través de Thy-1 y sus receptores, regula la migración de los astrocitos modificando la señalización intracelular, la permeabilidad de la célula y generando un fenómeno de transactivación que induce cambios en el comportamiento celular. Comprender cómo cambia el comportamiento de los astrocitos frente a la interacción con Thy-1 es importante para generar oportunidades terapéuticas y posibles blancos farmacológicos para contrarrestar la inhibición del crecimiento axonal relacionada con esta interacción. A partir de los resultados obtenidos en este trabajo aparecen numerosas preguntas nuevas, por ejemplo qué vías se relacionan con la apertura de los hemicanales y cómo estas rutas se conectan con cambios en la adhesividad y migración de los astrocitos. Importante será también comprender el papel que tiene Síndecan-4 en la liberación de ATP inducida por Thy-1 y en la respuesta de los astrocitos de cultivo primario a Thy-1 en un contexto inflamatorio. Finalmente, llevar este conocimiento obtenido en modelos celulares a un modelo animal con perspectivas de tratamiento sería un objetivo clave para reforzar esta investigación

Astrocytes respond to inflammatory stimuli by modifying their morphology and gene expression pattern, and participate in the formation of the glial scar in the case of a traumatic lesion. This glial scar represents a non-permissive environment for axonal regeneration that harbors many inhibitory molecules thought to be responsible for the poor capacity of neurons in the Central Nervous System to repair themselves. In this context, molecules like Chondroitin sulfate proteoglycans secreted by astrocytes, the Nogo protein present on the surface of oligodendrocytes and, importantly for our studies, the neuronal surface glycosyl phosphatidylinositol protein Thy-1, all are highly relevant. For many years, our laboratory has focused on the study of Thy-1 function and signaling. We have shown that Thy-1 inhibits axonal growth and engages in cell-cell interactions. We have also demonstrated that these effects are elicited through the interaction with two receptors present in DITNC1 astrocytes: αvβ3 Integrin and Syndecan-4. We have observed that short-term interaction of Thy-1 with these two receptors enhances astrocyte adhesion; however, following prolonged stimulation, Thy-1 induces astrocyte migration. Thy-1 interaction with its receptors induces the activation of signal transduction pathways in astrocytes that increase RhoA and Rac1 GTPase activity with different kinetics. Thy-1 also induces ATP release from the astrocytes, resulting in the activation of the P2X7 receptor and entry of extracellular calcium. We know that these signals are necessary for astrocyte adhesion. However, how ATP is released in response to Thy-1 remains to be determined. Also whether extracellular ATP and P2X7 receptor activation are required for DITNC1 astrocyte migration induced by Thy-1 is unknown. These and related questions we sought to answer with the studies described in this thesis. On the other hand, results from our laboratory have shown that, in contrast to DITNC1 cells, primary astrocytes in culture do not respond to Thy-1 and express very low levels of β3 integrin, which however increase under pro-inflammatory conditions, such as those produced in the brain by a stroke. Because astrocytes undergo morphological changes and migrate under these conditions in an attempt to limit and repair the damage, we hypothesized that the different responses observed in DITNC1 cells and primary astrocytes, after Thy-1 stimulation, are due to the different levels of integrin expression observed in the two types of cells. Therefore, in this study we propose that DITNC1 cell migration induced by Thy-1 requires ATP release into the extracellular space – by still unknown mechanisms – and P2X7 receptor activation. Furthermore, we hypothesize that primary astrocytes do not respond to Thy-1 due to their low levels of β3 Integrin expression. In order to study ATP release from the astrocytes, and the signaling pathways involved, we measured extracellular ATP by luminescence techniques, and evaluated calcium kinetics by loading the cells with fluorescent probes, and follow fluorescent dye uptake. To assess the requirements of astrocyte migration induced by Thy-1, we performed wound healing and cell polarity assays. The participation of the different molecules in the mechanisms under study was analyzed by the use of pharmacological inhibitors, channel blockers or receptor antagonists. Also, expression of some of these molecules was modified using shRNA and siRNA or other approaches. Primary astrocyte responses to Thy-1 were monitored in cortical astrocytes treated or not treated with pro-inflammatory cytokines, such as TNFα. Then, changes in β3 Integrin expression were analyzed by Western Blotting, and astrocyte migration was evaluated using the wound healing assay under different conditions, including silencing or overexpression of β3 Integrin. The results shown in this study indicate that ATP release induced by Thy-1 required the interaction with both αvβ3 Integrin and Syndecan-4 receptors. Mutation of the integrin-binding site completely abolished the response, while mutation in the heparin-binding domain decreased and delayed ATP release. We further demonstrate that ATP release occurred through Connexin 43 and Pannexin 1 hemichannels, which are opened by a mechanism that required an increase in intracellular calcium stored in the endoplasmic reticulum. This calcium was released to the cytoplasm through IP3R receptor activation. ATP release was necessary for the increase of both average focal adhesion area and the number of focal adhesions per cell induced by stimulation for short periods with Thy-1. Prolonged stimulation induced DITNC1 cell polarization and migration, and both of these effects required the opening of hemichannels, the presence of extracellular ATP and P2X7 receptor activation. Treatment of astrocytes with BzATP, a P2X7 receptor agonist, stimulated cell migration at high concentrations. However, our study shows that DITNC1 astrocytes treated with low concentrations of BzATP, which did not induce cell migration, were able to migrate upon co-stimulation with a mutant form of Thy-1 lacking the integrin-binding site, but with an intact heparin-binding domain, suggesting that increases in extracellular ATP requires the integrin-binding site of Thy-1. These results also indicate that activation of the P2X7 receptor by ATP (or BzATP) and downstream signaling induced by Thy-1 through Syndecan-4, are necessary for astrocyte migration. Primary astrocytes changed their phenotype after treatment with TNFα, increased the expression of β3 Integrin, GFAP and P2X7 receptor, and migrated in response to Thy-1. Furthermore, experiments in which β3 Integrin was overexpressed or silenced indicated that after treatment with pro-inflammatory agents, the observed responses to Thy-1 depended on the expression of this integrin. Migration of TNFα-treated astrocytes induced by Thy-1 also required extracellular ATP and the activation of the P2X7receptor. These results improve our understanding of the role that astrocytes play during an inflammatory response after damage to the Central Nervous System. They also uncover mechanisms relevant to how neuron-astrocyte interactions, established via neuronal Thy-1 and its astrocytic receptors, regulates astrocyte migration, modifies intracellular signaling, cell permeability and generates changes in cell behavior. These results set the stage for future studies that will yield a deeper understanding of how astrocytes change their behavior after interacting with Thy-1. These insights may eventually help in generating therapeutic opportunities and pharmacological targets to counteract the inhibition of axonal growth ascribed to interaction with astrocytes. With our results, new questions arise. For example, which pathways are related to the opening of hemichannels? How do these pathways regulate changes in adhesion and migration of astrocytes? What role does Syndecan-4 play in ATP release induced by Thy-1? What is the role of Syndecan-4 in primary astrocytes stimulated with Thy-1 under inflammatory conditions? Finally, it would be very interesting to compare these results with the responses that are observed in animal models. In conjunction, these approaches may eventually help to define new approaches for the treatment of patients with post-trauma brain damage