p53-related protein kinase (PRPK) es necesario para la dinámica del citoesqueleto de actina y la migración de hemocitos, a través de su interacción con Rab35 e independiente del complejo KEOPS en Drosophila

Abstract

La migración celular es un proceso esencial en organismos pluricelulares, cobrando gran importancia durante la embriogénesis y en la respuesta inmune. Para migrar las células deben ser capaces de generar protrusiones fuera del margen celular. Los principales tipos de protrusiones generados por la polimerización de actina son lamelipodios y filopodios, siendo los primeros generados a través del complejo Arp2/3 (Actin related protein). Se ha reportado que la polimerización de actina es regulada por varias GTPasas pequeñas, entre ellas Rab35, la cual recluta a Rac1 y Cdc42 a sitios de formación de protrusiones modulando la formación de lamelipodios y filopodios, respectivamente. PRPK (p53 related protein kinase) es una quinasa atípica, altamente conservada perteneciente al complejo KEOPS (kinase, putative endopeptidase and other proteins of small size), el cual modula la eficiencia del reconocimiento de codones de tipo ANN. En Drosophila se ha visto que PRPK es necesario para la integración de las señales de la vía PI3K/TOR, las cuales se traducen en crecimiento celular y proliferación. Sin embargo, hemos visto que la pérdida de función de PRPK altera la forma celular en hemocitos-células inmunes homólogas a los macrófagos-, generando un fenotipo estrellado, similar a la pérdida de función del complejo Arp2/3. Este fenotipo es suprimido al co-expresar Rab35. También se ha reportado la interacción física entre PRPK y Rab35 en células humanas. Con estos antecedentes me propuse determinar si PRPK posee un rol fuera del complejo KEOPS, participando en la dinámica de protrusiones de membrana y el patrón de migración de hemocitos en Drosophila melanogaster. Para ello manipulamos los niveles de PRPK en tiempos y tejidos específicos a través del sistema Gal4/UAS. Se analizó la dinámica del citoesqueleto de actina y los parámetros de migración celular mediante microscopía confocal, en contextos particulares de migración y cultivo celular. Finalmente se realizaron co-inmunoprecipitaciones para determinar la interacción física entre PRPK-Kae1 (otro miembro del complejo KEOPS) y PRPK-Rab35. Los resultados obtenidos en esta tesis muestran que la pérdida de función de PRPK altera la dinámica del citoesqueleto de actina in vitro, el patrón de migración de hemocitos en estadios embrionarios, disminuye el reclutamiento de hemocitos en larvas en respuesta a un daño tisular y disminuye la velocidad de migración de hemocitos en estadío pupal. También se corroboró la interacción física entre PRPK y Rab35 y, aún cuando PRPK interactúa con Kae1, se concluyó que el rol de PRPK en la determinación de la forma celular se debe a un rol no canónico fuera del complejo KEOPS. Estos resultados sugieren que PRPK posee dos roles: Integración de señales de crecimiento y migración celular

Cell migration is an essential process in multicellular organisms, gaining great importance during embryogenesis and in the immune response. To migrate the cells must be able to generate protrusions outside the cell margin. The main types of actin protrusions are lamellipodia and filopodia, both generated by actin polymerization through the Arp2/3 (Actin related protein) complex. It has been reported that the activation of numerous small GTPases complex including Rab35, which recruits Rac1 and Cdc42 to the site of protrusions formation, where the latter are involved in the formation of lamellipodia and filopodia respectively. p53-related protein kinase (PRPK) is a highly conserved atypical kinase. It is a member of the KEOPS (kinase, putative endopeptidase and other proteins of small size) complex, which modulates the efficiency of recognition of ANN codons. In Drosophila PRPK is necessary for the translation of PI3K/TOR growth signals, which lastly support cell growth and proliferation. However, we observed that loss of function of PRPK alters cellular shape in haemocytes -macrophage-like cells-, generating a star-like phenotype which is also observed in loss of function of the Arp2/3 complex. The phenotype is suppressed by co-expressing Rab35. Also, it has been reported physical interaction between PRPK and Rab35 in human cells. With all this evidence I decided to determine if PRPK has a function independent of the KEOPS complex participating in the dynamics of membrane protrusions and migration pattern of haemocytes in Drosophila melanogaster. To do this, we manipulated PRPK levels in tissues and times specific through the Gal4 / UAS system. In particular contexts, migration and cell cultures, the actin cytoskeleton dynamics and cell migration's parameters were analyzed by confocal microscopy. Finally co-immunoprecipitations were performed to determine the physical interaction between PRPK-kae1 (another member of the complex KEOPS) and PRPK-Rab35. The results obtained in this study show that the loss of function of PRPK alters the dynamics of membrane protrusions in vitro and the migration pattern of embryonic haemocytes, reduces the recruitment of larval haemocytes in response to tissue damage and decreases haemocyte migration rate in pupal stage. We confirmed the physical interaction between PRPK and Rab35 and even when PRPK interacts with kae1, it was concluded that the role of PRPK in determining cell shape is due to a non-canonical role independent of the KEOPS complex. These results suggest that PRPK has two roles: Integration of growth signals and cell migration