Rol de la respuesta a proteínas mal plegadas en la actividad supresora de tumores de Caveolina-1

Abstract

El cáncer es la segunda causa de muerte a nivel mundial y en Chile luego de las enfermedades cardiovasculares. Importantemente, las muertes por cáncer van en aumento. Los avances más recientes en el entendimiento de las vías de señalización involucradas en cáncer, ha permitido la identificación de marcadores tempranos y tardíos de la carcinogénesis, los cuales son fundamentales para el diagnóstico y la prognosis del paciente. Basados en estos descubrimientos, existen disponibles nuevas terapias para el tratamiento de esta enfermedad. En esta perspectiva, una respuesta generada en el retículo endoplasmático (RE), denominada unfolded protein response (UPR) ha llamado la atención en el estudio del cáncer en la última década. En células eucariontes, la mayoría de las proteínas secretadas y de transmembrana se pliegan y maduran en el lumen del RE. Las proteínas entran al RE como cadenas polipeptídicas no plegadas cuyo flujo hacia el RE varía en respuesta a condiciones del medio y el estado fisiológico de la célula. De acuerdo a estos requerimientos las células ajustan la capacidad de plegamiento de proteínas del RE asegurando el mantenimiento de la fidelidad del proceso. Este control homeostático es realizado a través de vías de transducción de señales iniciadas por proteínas de transmembrana del RE cuyas porciones luminales sensan el estado de plegamiento de proteínas en el RE y sus regiones efectoras citoplasmáticas señalizan hacia el citoplasma y núcleo. Una de las evidencias que sustenta el rol de la UPR en cáncer está relacionada con la alta tasa de proliferación de células cancerosas observada durante el desarrollo tumoral. Este fenómeno requiere de una elevada síntesis de proteínas y de membrana. Adicionalmente, la proliferación celular asociada al crecimiento tumoral ocurre en condiciones hipóxicas y en presencia limitada de nutrientes. La señalización de la UPR involucra al menos tres sensores distintos localizados en la membrana del RE; IRE1-α, ATF6 y PERK. Estos receptores comparten dominios sensores similares en el lumen del RE y bajo condiciones de stress de retículo in vitro, son simultáneamente activados Caveolina-1 (Cav-1) una proteína de andamiaje asociada a la membrana ampliamente expresada que ha sido descrita como una proteína supresora de tumores. Estudios de nuestro laboratorio, han relacionado esta actividad con su localización en la membrana plasmática y asociada a E-Cadherina. Sin embargo, en modelos celulares de cáncer carentes de E-Cadherina, Caveolina-1 mantiene su rol como supresor de tumores. Estas observaciones indican que esta supresión de tumores puede ocurrir mediante mecanismos independientes de E-Cadherina. Adicionalmente en estos modelos, Cav-1 es altamente prevalente intracelularmente, unida a la membrana de organelos. Estas observaciones han hecho surgir la pregunta si la presencia de Cav-1 en estos organelos, pudiese estar relacionada con la actividad supresora de tumores de Cav-1 en ausencia de E-Cadherina. Con los antecedentes anteriormente mencionados, el objetivo de esta tesis fue evaluar in vivo en un modelo murino inmunocompetente, si la función de Cav-1 como supresor de tumores tenía relación con la vía adaptativa UPR y luego analizar in vitro cómo Caveolina-1 afecta la UPR. Para la primera parte, se utilizaron como modelo células de melanoma B16F10, singénicas con la cepa de ratón C57-BL/6. El análisis de diferentes parámetros en tumores formados por las células B16F10 fueron empleados para establecer una conexión entre la expresión de Cav-1 y la modulación de la vía de UPR in vivo. Los ensayos in vivo mostraron que Cav-1suprimió la formación de tumores. Se observó una reducción del 60 % en el tamaño en aquellos tumores formados por las células que expresaron Cav-1 comparado con las que no la expresaron. El hallazgo más importante observado en tumores generados por células que expresan CAV-1 fue la reducción de genes blanco regulados por las vías señalización de los sensores IRE1-α y PERK de la UPR. Esta regulación negativa fue observada además a nivel de proteínas y se mantuvo incluso en tumores de igual tamaño. En modelos de inducción clásicos de estrés de retículo in vitro, se utilizó hipoxia y el tratamiento con el inhibidor de la glicosilación, tunicamicina. En estos experimentos, nuevamente la presencia de Cav-1 se relacionó con una disminución en los niveles transcripcionales y de sus respectivos blancos proteicos río abajo de IRE1-α y PERK. Además la expresión de Cav-1 se asoció con un aumento en la muerte celular luego de 24 h de tratamiento con tunicamicina o exposición a hipoxia. Resultados similares se obtuvieron in vitro en otra línea celular metastásica de cáncer de mama humano (MDA-MB-231). El rol supresor de tumores de Cav-1 es a menudo atribuido a interacciones proteína-proteína mediadas por el dominio de andamiaje de Cav-1 (CSD), la que frecuentemente resulta en la inactivación de estas proteínas. Es por esto que para evaluar la relevancia de este dominio en la supresión de tumores y la regulación negativa de la UPR, se realizaron distintas mutaciones sitio-dirigidas en aminoácidos potencialmente interesantes de este dominio y sus alrededores para analizar su efecto en el rol supresor de tumores y sobre la UPR. Las mutantes Cav-1(S80A) y (S80E), pierden su capacidad de suprimir crecimiento tumoral y a diferencia de Cav-1(WT), generan tumores de tamaño similar a los generados por células que carecen de la expresión de Cav-1. Por el contrario, tumores generados a partir de células que expresaron Cav-1(W98F) y (W1280F), se comportaron como los tumores generados a partir de de Cav-1(WT). Del mismo modo, La inhibición de la UPR observada para de Cav-1(WT) se pierde en tumores generados por las mutantes Cav-1(S80A) y (S80E) pero no en aquellos que se generan a partir de Cav-1(W98F) y (W1280F). En resumen, los resultados obtenidos en esta tesis, indican que la presencia de Cav-1 en compartimentos intracelulares, tales como el retículo endoplasmático y la inhibición ahí de la UPR están relacionadas con la supresión de tumores de Cav-1 independiente de E-Cadherina. Este trabajo además provee de evidencia que Cav-1 suprime UPR in vitro e in vivo y que el residuo aminoacídico S80 es requerido para suprimir la formación de tumores así como también para inhibir UPR

Cancer is the second most important cause of death worldwide and also in Chile after heart diseases. Importantly, deaths caused by cancer are on the rise. More recent advances in our understanding of cancer signaling pathways have led to the identification of early and late stage markers of carcinogenesis important for patient diagnosis and prognosis. Also, based on such insight, new therapies to treat this disease have become available. Particularly, in this perspective, a stress response generated in the endoplasmic reticulum (ER), referred to as the unfolded protein response (UPR) has attracted a great deal of attention in cancer research in the last decade. In eukaryotic cells, most of the secreted and transmembrane proteins are folded in the ER lumen. The proteins enter into the ER as unfolded polypeptide chains and the extent of transport into this compartment varies in response to environment signals or the physiological status of cells. According to the specific demands, cells adapt their protein folding capacity in order to preserve the fidelity of the process. This process that seeks to maintain ER homeostasis is controlled by signal transduction events initiated by ER transmembrane receptor proteins whose luminal domains sense the protein folding status and then convey signals toward the cytoplasm and nucleus via the cytosolic domains. The importance of UPR in cancer is linked to the high proliferation rates developed by cancer cells during tumor growth, which in turn require augmented protein and membrane synthesis capacity. Additionally, such tumor growth frequently occurs in hypoxia and under conditions of limited nutrient availability. All these events posit the UPR as a crucial adaptive response during tumor growth. The UPR signaling pathway involves at least three distinct sensors located in the ER membrane: IRE1-, PERK, and ATF6. These receptors share luminal sensing domains and under stress conditions in vitro they are simultaneously activated. However, the extent of activation and hence the capacity to respond to stress depends on a large variety of ER associated factors, one of them potentially being the protein caveolin-1. Caveolin-1 (Cav-1) is a broadly expressed, membrane-associated scaffolding protein that has been described to function as a tumor suppressor. Studies from our laboratory have linked this ability to its localization in the plasma membrane and association there with E-cadherin. However, in cancer cell models lacking E-Cadherin, Cav-1 still functions as a tumor suppressor, albeit less efficiently. These observations indicate that Cav-1 tumor suppression may occur via mechanisms that are independent of E-cadherin, additionally, in such models; Cav-1 was highly prevalent in intracellular, membrane-bound compartments. These observations raised the question as to whether the presence of Cav-1 in these organelles could be related to the Cav-1 tumor suppressor activity in the absence of E-cadherin. With this in mind, the objective of this thesis was to evaluate in vivo in an immunocompetent mouse model, whether the function of Cav-1 as tumor suppressor was related to the adaptive UPR signaling pathway and then to analyze in vitro how Cav-1 affects the UPR. To test the first part, we used the syngenic mouse melanoma cell line B16F10 in the murine strain C57-BL/6. The analysis of different parameters in tumors formed by B16F10 cells were employed to establish a connection between the expression of Cav-1 and the modulation of the UPR pathway in vivo. The in vivo assays showed that Cav-1 suppressed tumor growth. A 60% reduction in tumor size was observed in tumors generated by B16F10 cells expressing Cav-1, as compared to those generated by cells lacking Cav-1. Importantly, in the tumors generated by Cav-1 expressing cells, a reduction in the transcription of target genes regulated downstream of the UPR sensors IRE1-α and PERK was observed. This down-regulation was observed also at the protein levels and the observed differences were maintained in tumors of the same size. In in vitro experiments, classic ER stress inducers, such as hypoxia and treatment with the glycosylation inhibitor tunicamicyn were employed. Here too, the presence of Cav-1 was linked to a reduction in the transcription of target genes downstream of IRE1-α and PERK that coincided with reduced protein levels of the respective target proteins.Cav-1 expression was associated with an increase in cell death after 24 h of treatment with tunicamicyn or exposure to hypoxia. Of note, similar results were obtained in vitro using the aforementioned B16F10 cells and also the metastasic human breast cancer cell line MDA-MB-231. Cav-1 tumor suppression is often attributed to protein-protein interactions mediated by the Cav-1 scaffolding domain (CSD) that often lead to inactivation of Cav-1 binding partners. To test the relevance of the CSD in tumor suppression and UPR down-regulation, several potentially interesting amino acids were altered by site-directed mutagenesis in the CSD and flanking regions and their impact on Cav-1-mediated inhibition of UPR and tumor growth were assessed. The Cav-1(S80A) and (S80E) mutants lost their ability to suppress tumor formation, and unlike Cav-1(WT) expressing cells generated tumors similar to those formed by Cav-1 lacking B16F10 cells. On the contrary, tumors generated by cells expressing the Cav-1(W98F) and (W128F) mutants behaved essentially the same as Cav-1(WT) expressing cells. Likewise, Cav-1-mediated UPR inhibition observed for tumors generated by Cav-1(WT) expressing cells was lost in tumors generated by cells expressing the S80A and S80E mutants, but not in those expressing the W98F and W128F mutants. In summary, the results obtained in this thesis indicate that the presence of Cav-1 in intracellular compartments, such as the ER, and inhibition there of the UPR is linked to Cav-1 tumor suppression independent of E-cadherin. We also provide evidence showing that Cav-1 suppressed the UPR in vitro and in vivo, and that the amino acid residue S80 is required for Cav-1 to suppress tumor formation and inhibit the UPR