Comparación de las técnicas de inmunofluorescencia, TR-RCP multiplex en tiempo real y Luminex en la detección de virus respiratorios en adultos con neumonía adquirida en la comunidad

Abstract

La neumonía adquirida en la comunidad (NAC) es una inflamación del epitelio respiratorio que afecta mayormente a menores de 5 años y mayores de 75 años. En el mundo es la 3° causa de muerte con un 6,7% de mortalidad y en Chile representa el 20% de la mortalidad en la población general, constituyendo un problema de salud pública. En adultos los agentes etiológicos más frecuentes son bacterianos; sin embargo, en los últimos años se ha reconocido a los virus respiratorios como causa frecuente de NAC, siendo los más comunes el virus influenza (FLU), respiratorio sincicial (VRS), parainfluenza (PiV) y adenovirus (AdV). Los adultos presentan una menor excreción viral, por lo que se requieren técnicas de mayor sensibilidad. Existen diversos métodos para el diagnóstico, incluyendo la detección de antígenos por inmunofluorescencia (IF), de genoma por la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (TR-RCP) en tiempo real y la más reciente Luminex®, de la cual existen pocas publicaciones que avalen su efectividad y no se dispone de información en nuestro país, a pesar de su gran potencialidad. En este trabajo se comparó la efectividad de las técnicas de IF, TR-RCP en tiempo real y Luminex®, en la detección de virus respiratorios, en muestras de adultos con NAC, analizando su rendimiento, complejidad de ejecución y costos de implementación. Se estudiaron 113 pacientes mayores de 18 años hospitalizados por NAC. De cada uno se registraron los antecedentes clínicos y se obtuvo una muestra respiratoria para detectar virus por IF clásica (FLU A/B, VRS, PiV 1-3, AdV con Sigma® y Metapneumovirus (MPVh) con Hybrid Diagnostics®) y rápida (Hybrid Diagnostics®); por TR-RCP en tiempo real con el sistema comercial multiplex para virus respiratorios (Sacace Biotechnologies®) y por Luminex® (xTAG® RVP). Se analizó el rendimiento de las técnicas con características demográficas y clínicas de los pacientes mediante las pruebas estadísticas: Z, t y de correlación de Pearson con un p< 0.05 como significativo. Se determinó la sensibilidad, especificidad, valores predictivos, coeficiente de concordancia Kappa (κ), la curva ROC y las áreas bajo la curva (AUC) con el programa estadístico GraphPad Prism®. El rendimiento de la RT-RCP (49,6%) y de Luminex® (53,1%) fue similar (p=0,6) y ambos fueron significativamente mayores que la IF clásica (2,7%) y rápida (0%) (p=0). Rinovirus (RVh, 31,8%) y FLU A/B (14,2%) fueron los agentes detectados con mayor frecuencia. Luminex® coincidió con la TR-RCP en todas las detecciones de VRS (4,4%) y MPVh (1,8%) y fue el único que detectó Coronavirus (CoVh, 1,8%). La IF clásica solo detectó 1 caso de VRS (1%) y 2 de FLU A/B (1,9%). Respecto a la TR-RCP, la sensibilidad, especificidad, coeficiente κ y la AUC de Luminex® fue 89,9%, 82,5%, 0,7 y 0,86 y de la IF clásica fue 11,5%, 100%, 0,2 y 0,53 respectivamente. Se estableció una relación inversamente proporcional entre la fluorescencia (MFI) de Luminex® y el Ct de la TR-RCP para las detecciones coincidentes del total de muestras y las de RVh (p<0,0001). No se encontraron diferencias significativas en los datos demográficos, clínicos y de evolución entre los pacientes con detección viral por Luminex® y por RT-RCP. Luminex® permitió estudiar simultáneamente un mayor número de virus y de muestras, pero su costo y tiempo de procesamiento son más altos que las otras técnicas. En conclusión, Luminex® posee una buena sensibilidad y especificidad para detectar virus respiratorios en adultos con NAC, en comparación a la TR-RCP, por lo que esta técnica es una opción apropiada para el diagnóstico viral de estos pacientes aunque su implementación en la rutina de un laboratorio puede estar dificultado por su aun alto costo. Por el contrario, la IF no debiera usarse en la detección de virus respiratorios en adultos

Community acquired pneumonia (CAP) is an inflammation of the respiratory epithelium. It affects mostly children younger than 5 and adults older than 75 years. It’s the third cause of death worldwide, with a 6.7% mortality rate and represents a 20% mortality in general population in Chile, becoming a public health problem. In adults, the most frequent etiologic agents are bacteria; but in the last few years, respiratory viruses were acknowledged as frequent causes of CAP; influenza virus (FLU), respiratory syncytial virus (RSV), parainfluenza virus (PiV) and adenovirus (AdV) being the most common. Adults present low viral excretion, for it is required techniques with great sensibility. There are various diagnostics methods, including antigen detection by immunofluorescence assay (IFA), genome detection by real time polymerase chain reaction with retrotranscription (RT-PCR) and the most novel Luminex®, of which are few papers that prove its effectivity and there is no information for our country, despite its great potential. In this work, the performance of IFA, real time RT-PCR and Luminex® was compared in the detection of respiratory viruses in adults with CAP, analyzing performance, execution complexity and mounting costs. 113 patients above 18 years hospitalized with CAP were enrolled. For each one, clinical data were registered and a respiratory sample was obtained for detecting respiratory viruses by classic IFA (FLU A/B, PiV 1-3, RSV, AdV, Sigma®; human Metapneumovirus (hMPV), Hybrid Diagnostics®), fast IFA (Hybrid Diagnostics®), multiplex real time RTPCR for respiratory virus (Sacace Biotechnologies®) and by Luminex® (xTAG® RVP). Performance of each technique and demographic and clinical data were analyzed by statistical tests: Z, t and Pearson correlation with a p<0.05 as significate. Sensitivity, specificity, predictive values, Kappa (κ) value, ROC curve and area under curve (AUC) were calculated using GraphPad Prism® statistical software. In respiratory virus detection, the performance of RT-PCR (49.6%) and Luminex® (53.1%) were similar (p=0.6) and both were significantly higher than classic (2.7%) and rapid IFA (0%) (p=0). Human rhinovirus (hRV, 31.8%) and FLU A/B (14.2%) were the most frequently detected agents. Luminex® presented the same detections as RT-PCR for RSV (4.4%) and hMPV (1.8%) and was the only one able to detect human coronavirus (hCoV, 1.8%). Classic IFA only detected 1 case of RSV (1%) and 2 of FLU A/B (1.9%). In comparison to the RT-PCR, sensibility, specificity, Kappa value and AUC obtained by Luminex® was 89.9%, 82.5%, 0.7 and 0.86 and the values obtained by classic IFA was 11.5%, 100%, 0.2 and 0.53. An inverse proportional relation was established between Luminex® fluorescence (MFI) and RT-PCR Ct values for coincident detection in all samples and for hRV detection (p<0.0001). There are no significant differences in demographic, clinical and disease evolution data between patients with viral detection by Luminex® or RT-PCR. Luminex® possesses the biggest sample processing capability and viral type detection, but is more expensive and has the biggest processing time lapse than the other techniques. Finally, Luminex® possesses a high sensibility and specificity for detecting respiratory viruses in adults with CAP in comparison to RT-PCR, showing that it is a good and appropriate option for viral diagnosis in these patients, although its implementation in a routine diagnostic laboratory could be difficult for its high costs. On the contrary, classic IFA had a low performance and should not be used in detecting respiratory viruses in adults