Generación de bacteriófagos antitumorales específicos del antígeno carcinoembrionario (CEA) para el desarrollo de una inmunoterapia contra cánceres del aparato digestivo

Abstract

Los cánceres del aparato digestivo (CAD) son, en su conjunto, la principal causa de defunciones por cáncer a nivel mundial. Pese al gran desarrollo de diversas terapias, el tratamiento contra este tipo de cáncer continúa siendo poco eficaz y conlleva un amplio número de efectos secundarios que disminuyen la calidad de vida del paciente. Esto hace necesario investigar y desarrollar nuevas terapias que combatan de forma específica y eficaz el desarrollo de tumores. En la actualidad, la inmunoterapia es una de las estrategias terapéuticas más promisorias. El sistema inmune posee el potencial de reconocer y eliminar específicamente a las células tumorales mediante el reconocimiento de proteínas expresadas diferencialmente en estas células, denominadas antígenos tumorales. Sin embargo, el tumor genera un microambiente que inhibe la respuesta inmune antitumoral, por lo que el desarrollo de terapias capaces de interrumpir esta inhibición puede permitir que el sistema inmune elimine eficientemente las células tumorales. Actualmente existen dos tratamientos de este tipo aprobados para su uso en humanos. El antígeno carcinoembrionario (CEA) es una proteína de superficie altamente expresada en una gran variedad de CADs y por ende, un blanco atractivo para el desarrollo de inmunoterapias específicas contra este conjunto de cánceres. En este trabajo se generó un bacteriófago filamentoso M13 específico contra CEA para ser usado en una futura inmunoterapia como un agente inmunogénico que se una a CEA en la superficie de las células tumorales. Así, el fago, a través de su ADN genómico de hebra simple, activará a las células del sistema inmune innato infiltrantes del tumor y promoverá un microambiente proinflamatorio capaz de revertir la inmunosupresión del tumor y permitir que la respuesta inmune adaptativa elimine a las células tumorales de forma específica. El bacteriófago anti-CEA se generó en cultivos de E. coli transformadas con fagomio e infectadas con un fago auxiliar. El fagomidio pSEX81 permitió expresar un fragmento variable de anticuerpo de cadena simple (scFv) específico contra CEA fusionado a la proteína pIII. El fago auxiliar (denominado hiperfago) permitió expresar las proteínas que conformarán la nueva partícula viral. La presencia de la proteína de fusión scFv-pIII en el bacteriófago M13 anti-CEA se confirmó mediante western blot usando un anticuerpo específico contra la proteína pIII. La especificidad del fago anti-CEA contra el antígeno CEA purificado se confirmó mediante ensayos de ELISA. Por otra parte, se comprobó in vitro que el bacteriófago anti-CEA se une a la proteína CEA expresada en la superficie de líneas celulares tumorales de origen humano y murino mediante citometría de flujo. Los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que este fago se unirá al antígeno tumoral CEA in vivo, convirtiéndolo en una potencial inmunoterapia contra CADs

Gastrointestinal cancers are the leading cause of cancer-related deaths worldwide. Despite the great development of cancer therapies, the treatment of this type of cancer remains ineffective and involves a large number of side effects that negatively impact the life quality of patients. In order to solve these problems, development of new therapies able to specifically and effectively eradicate tumors is needed. Currently, immunotherapy is one of the most promising therapeutic strategies. The immune system has the potential to specifically eliminate tumor cells by recognizing tumor antigens, which are proteins differentially up-regulated in these cells. However, tumors create an immunosuppressive microenvironment that inhibits the immune responses against the tumor, therefore development of therapies capable of disrupting this inhibition may allow the immune system to eliminate tumor cells efficiently. Currently, two drugs following this principle have been approved for human use. Carcinoembryonic antigen (CEA) is a surface protein highly expressed in a variety of gastrointestinal cancers, thus it is an attractive target for the development of immunotherapies targeting this type of cancers. In this thesis, a M13 filamentous bacteriophage able to bind CEA at the surface of tumor cells was generated as an immunogenic agent for a future immunotherapy. This CEA-specific M13 filamentous bacteriophage, through its genomic single-stranded DNA, is expected to activate tumor-infiltrating innate immune cells promoting a proinflammatory microenvironment capable of disrupting tumor-induced immunosuppression and allowing adaptive immune responses to efficiently eliminate tumor cells. Furthermore, this strategy will promote the presentation of tumor antigens and the generation of tumor-specific adaptive immune responses The CEA-specific bacteriophage was generated in E. coli cultures transformed with a phagemid and infected with a helper phage. The phagemid vector pSEX81 was used for generating the CEA-specific single chain variable fragment (scFv) fused to the pIII protein on the surface of M13 bacteriophages. The helper phage (or hyperphage) allowed the expression of the other viral proteins needed to form the bacteriophage particles. The presence of scFv-pIII fusion protein in CEA-specific bacteriophage preparations was confirmed by western blot analysis using an M13 pIII-specific antibody. The capability of the bacteriophage to specifically bind purified CEA in vitro was confirmed by ELISA. Moreover, it was demonstrated that the CEA-specific bacteriophage binds CEA expressed on the surface of mouse and human tumor cell lines. The results obtained in this thesis suggest that this CEA-specific bacteriophage will bind to CEA-expressing tumors in vivo, and it represents a potential immunotherapy against gastrointestinal cancer. The in vitro observed specificity of the anti-CEA M13 bacteriophage suggests that this phage will bind to this tumor antigen in vivo, making it a powerful tool for potential gastrointestinal cancer targeted immunotherapies