Rol inmunomodulador de la activación del receptor mineralocorticoides por corticosterona

Abstract

El inicio de la respuesta inmune adaptativa depende de la interacción específica entre células T CD4+ naïve y células presentadoras de antígenos (APCs). De todas las APCs, las células dendríticas (DCs) juegan un rol fundamental en la iniciación y regulación de la respuesta inmune adaptativa. Su función principal es la de capturar, procesar los antígenos y presentarlos a los linfocitos B y T para que éstos inicien la repuesta inmunológica. En este contexto, previamente nuestro grupo de investigación demostró que las DCs expresan el receptor de mineralocorticoides (MR), cuya activación por aldosterona induce la secreción de IL-6 y TGF-β, aumenta su capacidad para activar células CD8+ y promueve la polarización de las células T CD4+ hacia un perfil TH17 (rol pro-inflamatorio). Diversos estudios han evidenciado que productos del sistema nervioso y endocrino pueden tener efectos importantes sobre la función de las DCs. De este modo, se ha demostrado que la activación de MR por aldosterona genera una respuesta pro-inflamatoria y las activación del receptor de glucocorticoides (GR) por cortisol (corticosterona en modelo murino) genera una respuesta anti-inflamatoria. Sin embargo, la interacción entre estos receptores es más compleja, ya que cortisol puede unirse a MR con igual afinidad que aldosterona; no obstante, en algunos tejidos como el riñón existe una enzima que le confiere a MR selectividad por aldosterona denominada 11βhidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2 (11βHSD2), aunque en diversas células del sistema inmune se ha descrito la ausencia de esta enzima. Tradicionalmente, los glucocorticoides (GCs) han sido ampliamente utilizados en el tratamiento de enfermedades inflamatorias generando, a través de la activación de GR, una potente inhibición de la respuesta inmune. Pero, a pesar de los beneficios antiinflamatorios postulados, en pacientes que presentan un exceso de GCs han sido observados efectos adversos como hipertensión y daño cardiovascular. En estos casos, se ha propuesto que un exceso de GCs podría promover la excesiva activación MR, aumentando la respuesta pro-inflamatoria. Recientemente, se ha descrito en células del músculo liso vascular (VSMCs) un nuevo receptor capaz de activarse por hormonas corticosteroidales: el Receptor Acoplado a Proteína G-30 (GPR30), que en células endoteliales puede ser activado por estrógenos, aldosterona o cortisol, y cuya expresión no ha sido descrita en DCs. Por lo tanto, el efecto neto de aldosterona y cortisol dependerá de la concentración de cada ligando, el contexto celular y los niveles de expresión relativa de cada receptor en cada célula inmune, entre otros múltiples factores. Otro antecedente que centró nuestra atención fue que espinolactona (SPIRO), un antagonista competitivo de MR, sería capaz de inducir la expresión de hemo oxigenasa-1 (HO-1), enzima cuya actividad tiene efectos antioxidantes, anti-inflamatorios y anti-apoptóticos. Diversos estudios demuestran que las DCs expresan HO-1 y que esta expresión disminuye drásticamente como resultado del proceso de maduración y que la sobreexpresión de HO-1 en DCs, inhibe la maduración y la función pro-inflamatoria inducida por LPS. En este contexto, las DCs juegan un rol clave en la regulación de la inmunidad adaptativa y la activación de las células T, por lo tanto, el efecto de la HO-1 sobre la regulación de la función de las DCs puede ser altamente relevante para modular la respuesta inmune adaptativa. Basándonos en estos antecedentes nuestra hipótesis central fue que "corticosterona, a través de la señalización de MR, aumenta la capacidad de las células dendríticas para activar células T”. En primer lugar, para caracterizar nuevos moduladores de la función de las DCs, determinamos la expresión relativa de MR, 11βHSD2, GPR30 y las dos isoformas de GR por qRT-PCR, observando que DCs derivadas de médula ósea (bm-DCs) presentan niveles detectables de ARNm para estas proteínas, los cuales aumentaron cuando se indujo la maduración con LPS, a excepción de la isoforma GRα, cuyos niveles no varían con el proceso de maduración. Posteriormente, nos propusimos detectar la expresión de ARNm de MR, 11βHSD2 y GPR30 en otro tipo celular que cumple funciones de APC: los linfocitos B. Purificamos linfocitos B a partir de esplenocitos y mediante qRT-PCR determinamos los niveles de cada ARNm. Los datos obtenidos sugieren que los linfocitos B presentan niveles detectables de ARNm para GPR30 y MR, pero no para 11βHSD2. Como un objetivo adicional, nos propusimos determinar si espinolactona es capaz de aumentar los niveles de ARNm de HO-1 en bm-DCs, sin embargo, los datos que obtuvimos no son concluyentes, ya que solo se observó un ligero aumento en la expresión de HO-1. Por otro lado, centrándonos en nuestro objetivo principal, generamos bm-DCs y las estimulamos con corticosterona más RU486 (antagonista de GR) para promover la unión a MR, y luego analizamos los cambios en su fenotipo. En este caso, los datos sugieren que los estímulos utilizados no afectan significativamente la viabilidad de las bm-DCs y que el tratamiento previo con RU486 y posteriormente con corticosterona, disminuye la expresión de PDL-1 y aumenta la expresión de CD40 en bm-DCs. Finalmente, los datos obtenidos en esta tesis no nos permiten concluir categóricamente que corticosterona es capaz de activar MR e inducir un fenotipo pro-inflamatorio en las DCs, pero la disminución en la expresión de PDL-1 y el aumento de CD40 sugieren que las DCs tienden a adquirir dicho fenotipo. De manera siginificativa, nuestros resultados sugieren que las DCs expresan 2 proteínas que no habían sido descritas en este tipo celular: GPR30 y 11βHSD2, las cuales abren una nueva posibilidad de regulación de la función de las DCs

The initiation of the adaptive immune response depends on the specific interaction between T cells naïve CD4+ and antigen presenting cells (APCs). Of all the APCs, dendritic cells (DCs) play a critical role in the initiation and regulation of adaptive immune response. Their main function is to capture and process antigens and present them to T and B lymphocytes to initiate these immune response. In this context, previously, our research group showed that the DCs express the mineralocorticoid receptor (MR), and that its activation by aldosterone induce the secretion of IL-6 and TGF-β, increases its ability to activate CD8+ T cells and promotes polarization of CD4+ T cells toward a Th17 profile (associated with the inflammatory role). Diverse studies have shown that products and processes of the nervous and endocrine systems can have significant effects on the function of DCs. Thus, it has been shown that activation of MR by aldosterone generates a pro-inflammatory response, and the activation of the glucocorticoid receptor (GR) by cortisol (corticosterone in murine model) generates an anti-inflammatory response. However, the interaction between these receptors is more complex because cortisol can bind to MR with equal affinity that aldosterone; nevertheless , in some tissues, such as kidney, exists an enzyme that confers selectivity to MR by aldosterone called 11-β-hidroxysteroid dehydrogenase type 2 (11βHSD2), although in various cells of the immune system has been described the absence of this enzyme. Traditionally, glucocorticoids (GCs) have been widely used in the treatment of inflammatory diseases by generating, through the activation of GR, a potent inhibition of the immune response. But despite the postulated anti-inflammatory benefits in patients, with an excess of GCs have been observed adverse effects such as hypertension and cardiovascular damage. In these cases, it is suggested that an excess of GCs may promote excessive activation MR, increasing the pro-inflammatory response. Recently, it has been described in vascular smooth muscle cells (VSMCs) a new receptor that can be activated by corticosteroids hormones: G -protein coupled receptor-30 (GPR30). In endothelial cells, this receptor can be activated by estrogen, aldosterone or cortisol, but its expression has not been described in DCs. Thus, the net effect of aldosterone and cortisol depend on the concentration of each ligand, the cellular context and the relative expression levels in each immune cell, among other factors. Other antecedent that focused our attention was that spinolactone (SPIRO), a competitive antagonist of MR, would be capable of inducing the expression of heme oxygenase-1 (HO-1), an inducible enzyme by ligand and has antioxidant, anti-inflammatory and anti-apoptotic activity in kidney cells. Several studies show that DCs express HO-1, and that this expression decreases drastically as a result of the maturation process and that the overexpression of HO-1 in DCs inhibits maturation and pro-inflammatory function induced by LPS. In this context, DCs play a key role in the regulation of adaptive immunity and T cell activation, so the effect of HO-1 on the regulation of the function of the DCs may be highly relevant to modulate the adaptive immune response. Based on this background, our central hypothesis was that "corticosterone through MR signalling enhances the ability of dendritic cells to activate T cells”. First, to characterize in DCs novel modulators of the function expression, we determined the RNA relative levels of MR, 11βHSD2, GPR30 and the two isoforms of GR by qRT- PCR, observing that bone marrow-derived DCs (bm-DCs) have detectable levels of mRNA for these proteins, which are increased when maturation was induced by LPS, with the exception of GRα isoform, whose levels of expression does not change by this maturation process. Later, we decided to detect mRNA expression of MR, 11βHSD2 and GPR30 in another cell type which act as APCs: Blymphocytes. Our data suggest that B-lymphocytes have detectable RNAm levels for GPR30 and MR, but not for 11βHSD2. As a further object, we wanted to determine if spironolactone is able to increase HO-1 mRNA levels in bm-DCs, however, we obtained inconclusive data, as only a slight increase was observed in the HO-1 mRNA levels. On the other hand, focusing on our main aim, we generated bm-DCs and stimulated them with corticosterone and RU486 (a GR antagonist) to promote binding to MR and then we analysed changes in phenotype. In this case, the data suggest that the stimuli does not significantly affect the viability of the bm-DCs and that pre-treatment with RU486 and subsequently with corticosterone, decreases the expression of PDL-1 and increases expression of CD40 in bm- DCs. Finally, the data obtained in this thesis does not allow us to conclude categorically that corticosterone is able to activate of MR and induce a pro-inflammatory phenotype in DCs, but the decrease in expression of PDL-1 and increase in the CD40 levels suggests that DCs tend to acquire the pro-inflammatory phenotype. Significantly, our results suggest that DCs express two new proteins that had not been described in this cell type: GPR30 and 11βHSD2, which open a new possibility for regulating the DCs function