Ingeniería metabólica en escherichia coli: estudio de una enzima de interés para la ruta de biosíntesis de butanol a partir de la ruta del isovalerato

Abstract

Producto de la crisis energética actual y el consumo proyectado a futuro, se están buscando maneras de diversificar la matriz energética, abriéndose a diversas opciones de preferencia renovables. En este contexto surge la producción de energía a partir de biomasa como una alternativa viable debido principalmente a su carácter natural y renovable. Dentro de este tipo de energía los biocombustibles son candidatos prometedores debido a su capacidad de utilizarse en motores de combustión interna sin producir gases de efecto invernadero y sin la necesidad de modificar las tecnologías ya existentes para su uso, siendo el biobutanol la alternativa más destacada por sobre el resto. La producción de este tipo de biocombustible se ha tendido a desarrollar en los últimos años en plataformas biológicas, los llamados biocombustibles de tercera generación, debido principalmente al fácil acceso a la materia prima, las algas, y a la mayor eficiencia económica que este tipo de producción ofrece. La producción biológica del biobutanol se centra principalmente en dos rutas metabólicas: La ruta de síntesis de valina y la ruta de Ehrlich. Cinco enzimas regulan la síntesis del biobutanol mediante estas dos rutas metabólicas dentro de las cuales la que presenta los parámetros cinéticos más bajos y por ende es el cuello de botella del proceso de síntesis es la acetolactato sintasa. El objetivo del presente trabajo consiste en encontrar una enzima acetolactato sintasa en un microorganismo que presente parámetros cinéticos superiores a la mayoría de las enzimas de este tipo, para posteriormente expresar esta enzima en Escherichia coli de forma heteróloga y comparar los resultados en la producción de isobutanol con la enzima nativa de la bacteria. Se pretende además realizar mediante diseño racional in silico una mutación en la enzima heteróloga con el fin de mejorar la eficiencia catalítica de esta. Mediante búsqueda bibliográfica se determinó que la enzima acetolactato sintasa de Klebsiella pneumoniae posee parámetros cinéticos que la hacen una opción atractiva para este estudio. Se realizaron mutaciones sitio-dirigidas in silico en esta enzima y se estimaron los aumentos en la afinidad entre la enzima y el ligando. La mutación Y543R de la enzima presenta el mayor aumento en la afinidad por el sustrato dentro de las opciones probadas con un aumento del 12% en comparación con la original. No se logró expresar la enzima de forma heterologa en los experimentos de laboratorio debido a un error en el diseño de partidores que resultó en la expresión de una enzima oxido-reductasa de tamaño similar a la acetolactato sintasa. Se propone para futuros trabajos un ensayo de Nested PCR para la correcta obtención del gen que codifica la enzima acetotlactato sintasa a partir del DNA genómico de Klebsiella pneumoniae y una vez expresada correctamente la enzima realizar las comparaciones tanto en los parámetros cinéticos como en la producción de isobutanol con la enzima nativa de Escherichia coli y con la enzima heterologa mutada.