Participación del co-represor ski en el mantenimiento de la heterocromatina pericentromérica en modelo de epitelio mamario humano

Abstract

Ski es un co-represor transcripcional de la via de señalización TGFβ, entre otras. En fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs), la ausencia de Ski induce a defectos en la segregación cromosómica, alteraciones de SAC y aneuploidía. Recientemente, encontramos que en MEFs, Ski se localiza en la región pericentromérica de un número limitado de cromosomas mitóticos y esta localización está relacionada con cambios epigenéticos en la cromatina local. Para evidenciar la localización y potencial función de Ski sobre la estructura de los cromosomas en células humanas, evaluamos la presencia de esta proteína en cromosomas mitóticos por inmunofluorescencia indirecta (IFI) e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-qPCR) en las líneas celulares epiteliales MCF7 y MCF10A. Encontramos que en células MCF10A no-transformadas, Ski se localiza en la región pericentromérica de cromosomas acrocéntricos. En cambio, en células MCF7, la localización de esta proteína no es restrictiva a estos cromosomas. Para identificar el DNA satelital ocupado por Ski, diseñamos partidores cromosoma-específicos para el satélite beta (BSR) y el satélite humano II (HSatII) usando la herramienta RepeatMasker (UCSC). Los ensayos de ChIP-qPCR mostraron un enriquecimiento de la ocupancia de Ski en BSR en el cromosoma 15, y en HSatII en el cromosoma 22. Una disminución de los niveles de Ski a través de un shRNA en células MCF10A provocaron una reducción de la tri-metilación de la lisina 9 de la histona 3 (H3K9me3), mientras que la sobre-expresión de esta proteína en células MCF7 llevó a un incremento de los niveles de H3K9me3 en estas regiones. La marca de H3K9me3 es una característica de heterocromatina pericentromérica y es crítica para la formación apropiada del centrómero. En conjunto, estos resultados sugieren una función potencial de Ski sobre el mantenimiento de la heterocromatina pericentromérica en cromosomas humanos, lo cual podría tener un impacto importante sobre la segregación cromosómica y la estabilidad del genoma

Ski is a transcriptional co-repressor of TGFβ and other signaling pathways. In mouse embryonic fibroblasts (MEFs), absence of Ski leads to chromosome segregation defects and aneuploidy. Recently we found that in MEFs, Ski is located at the pericentromeric region of a limited number of mitotic chromosomes and that localization is related to epigenetic changes in the local chromatin. To assess the localization and potential function of Ski on chromosomal structure in human cells, we evaluated the presence of this protein on mitotic chromosomes by indirect immunofluorescence (IFI) and chromatin immunoprecipitation assays (ChIP-qPCR) in MCF7 and MCF10A breast epithelial cell lines. We found that in non-transformed MCF10A cells, Ski localizes at the pericentromeric region of acrocentric chromosomes, while in MCF7 cells Ski was not restricted to these chromosomes. To identify satellite DNA occupied by Ski, we designed chromosome-specific primers for Beta Satellite (BSR) and Human Satellite II (HSatII) sequences, using the RepeatMasker tool (UCSC). The ChIP-qPCR assays showed a enrichment of Ski occupancy in BSR at chr 15, and HSatII at chr 22. Decreasing Ski levels by shRNAs in MCF10A cells resulted in reduced trimethylation of Lys9 in Histone 3 (H3K9me3), while overexpression of Ski in MCF7 cells lead to increased H3K9me3 levels in these satellite regions. H3K9me3 is a feature of pericentromeric heterochromatin and is critical for proper centromere formation. Altogether, this data suggests a potential function of Ski on pericentromeric heterochromatin maintenance in human chromosomes, which could have a significant impact on chromosome segregation and genome stability