Sobre-expresión hepática de catalasa y su efecto en el consumo de alcohol en animales : desarrollo de vectores adenovirales codificantes de catalasa

Abstract

El alcohol es la droga más consumida en el mundo y su uso excesivo genera graves problemas. A pesar de la relevancia del alcoholismo, en la actualidad no existen herramientas farmacológicas efectivas para su tratamiento. El etanol se metaboliza en el hígado por acción de la alcohol deshidrogenasa (ADH) a acetaldehído, el cual es transformado a acetato por la aldehído deshidrogenasa (ALDH2). La catalasa hepática también metaboliza el etanol a acetaldehído pero en menor proporción. El fenofibrato es un fármaco hipocolesterolémico que activa el factor de transcripción PPAR-alfa (Receptor alfa activados por proliferadores de peroxisomas), induciendo la expresión de enzimas del metabolismo lipídico, entre ellas la catalasa. También se le han descrito acciones antiinflamatorias a nivel del SNC. Experimentos en ratas bebedoras de alcohol UChB mostraron que la administración de fenofibrato resulta en aumento de 3 veces en la actividad catalasa hepática y una reducción de 90% en la ingesta voluntaria de alcohol. Sin embargo, se desconoce si estos efectos son resultados de cambios a nivel periférico por una mayor producción de acetaldehído a nivel del hígado o por sus efectos antiinflamatorios a nivel central. Con el objetivo de poder disociar los efectos periféricos y centrales de fenofibrato, en esta tesis se desarrollaron vectores adenovirales que permitan la sobreexpresión selectiva de catalasa en tejido hepático de rata. Para ello, mediante recombinación homóloga en células E. coli AD-BJ5183 se obtuvieron plásmidos adenovirales recombinantes codificantes para catalasa y GFP (pAdV-GFP-catalasa) y codificante para GFP (pAdV-GFP). Posteriormente, estos plásmidos se transfectaron en células HEK-293 para obtener los vectores adenovirales AdV-GFP-catalasa y AdV-GFP. Los adenovirus se amplificaron en estas mismas células y se purificaron mediante doble gradiente de cloruro de cesio. Los títulos virales obtenidos fueron bajos para su uso in vivo, pero adecuados para estudiar su efecto en células hepáticas H4-II-E-C3. Estos estudios mostraron que el vector AdV-GFP-catalasa es funcional en células de origen hepático, aumentando la actividad y los niveles de catalasa, además se encontró que el vector AdV-GFP no generó cambios en la actividad y niveles de catalasa

Alcohol is the most consumed drug in the world and its excessive use generates serious problems. Despite the relevance of alcoholism, there are no effective pharmacological tools for its treatment. Ethanol is metabolized in the liver by the action of alcohol dehydrogenase (ADH) to acetaldehyde, which is converted to acetate by the aldehyde dehydrogenase (ALDH2). Hepatic catalase also metabolizes ethanol to acetaldehyde but to a lesser extent. Fenofibrate is a hypocholesterolemic drug that activates the PPAR-alpha (Alpha receptor activated by peroxisome proliferators) transcription factor, inducing the expression of lipid metabolism enzymes, including catalase. It has also been described anti-inflammatory actions at CNS level. Experiments in UChB alcohol drinking rats showed that the administration of fenofibrate results in 3-fold increase in hepatic catalase activity and 90% reduction in voluntary alcohol intake. However, it is unknown whether these effects are the result of changes at the peripheral level due to an increased production of acetaldehyde in the liver or due to its anti-inflammatory effects at central level. In order to dissociate between the peripheral and central effects of fenofibrate, adenoviral vectors that allow the selective overexpression of catalase in rat liver were developed in this thesis. To do this, recombinant adenoviral plasmids coding for catalase and GFP (pAdV-GFP-catalase) or coding for GFP (pAdV-GFP) were obtained by homologous recombination in E. coli AD-BJ5183 cells. Subsequently, these plasmids were transfected into HEK-293 cells to obtain the adenoviral vectors AdV-GFP-catalase and AdV-GFP. The adenoviruses were amplified in these same cells and purified by a double gradient of cesium chloride. The viral titers obtained were low for in vivo use, but adequate to study their effect on hepatic cells H4-II-E-C3. These studies showed that the AdV-GFP-catalase vector is functional in cells of hepatic origin, increasing the activity and the levels of catalase, in addition it was found that the AdV-GFP vector did not generate changes in the activity and levels of catalase