Efecto del pH y la disponibilidad de hierro sobre las modificaciones del lípido A de Helicobacter pylori y su impacto en la inmunogenicidad en células epiteliales AGS

Abstract

Helicobacter pylori es una bacteria Gram-negativo del grupo de las epsilonproteobacterias y uno de los pocos microorganismos capaces de colonizar el epitelio gástrico de los seres humanos, siendo el único patógeno asociado al desarrollo de úlceras pépticas y carcinomas gástricos. Se estima que su prevalencia en la población mundial es de alrededor del 50%, esto debido al desarrollo de múltiples estrategias y mecanismos que le permiten la evasión del sistema inmune del hospedero. Uno de los principales factores de virulencia de H. pylori es su lipopolisacárido (LPS), el mayor constituyente de la cara externa de su membrana externa. La porción de ésta molécula que la ancla a la membrana se denomina lípido A, y se caracteriza por ser el componente tóxico del LPS. Este glicolípido puede presentar modificaciones covalentes que alteran su bioactividad. En el caso de esta bacteria, el lípido A se distingue por ser una estructura altamente modificada que le confiere una baja inmunoreactividad al compararla con la misma molécula de enterobacterias. Hasta hace poco se consideraba que el lípido A de H. pylori presentaba una serie de modificaciones de carácter constitutivo, pero investigaciones recientes han logrado demostrar que existen algunas señales capaces de alterar la distribución de especies de lípido A. Entre las señales ambientales más importantes que el patógeno es capaz de detectar se encuentran: acidez, presencia de metales divalentes y algunos metabolitos del hospedero. Estas señales pueden ser vinculadas a la regulación de la virulencia y a la adaptación a las condiciones ambientales en las que se encuentra. En esta tesis se analizó el efecto de la acidez y la disponibilidad de hierro como factores ambientales determinantes en la distribución de especies de lípido A de H. pylori, debido a que son señales altamente vinculadas con la regulación de otros factores de virulencia como toxinas y algunos genes involucrados en la ruta biosintética del LPS de esta bacteria. Este trabajo incluyó un análisis en profundidad de arrays transcriptómicos que evidenció la relación entre el sensor de acidez (ArsS) y la expresión de genes que codifican enzimas modificadoras del lípido A. Además, se realizó una predicción de sitios de unión a Fur para apoyar la propuesta de que el hierro es un factor ambiental involucrado en la modificación del lípido A. También se evaluó la influencia de estos factores ambientales sobre las modificaciones del LPS de manera experimental, utilizando espectrometría de masas de lípido A y análisis de perfiles electroforéticos de LPS. Los espectros de masa indicaron que la disponibilidad de hierro provoca cambios menores en la distribución de especies del lípido A. En cambio, los espectros de las muestras obtenidas desde bacterias cultivadas con distinto pH muestran cambios más drásticos en la proporción de especies, siendo el más notorio un cambio en la especie mayoritaria detectada a pH 5 y 7. Este fenómeno no ha sido descrito para H. pylori y podría indicar un posible cambio en la actividad proinflamatoria del LPS de bacterias crecidas a estos pH. Por su parte, el análisis del perfil electroforético de estas muestras indicó que el LPS obtenido de H. pylori cuando se cultiva a pH 7 presenta diferencias en la intensidad de las bandas de movilidad intermedia respecto al LPS obtenido de bacterias cultivadas a pH 5. Finalmente, el efecto del LPS extraído desde H. pylori cultivado a distinto pH no muestra cambios significativos en la expresión de IL-8 en células AGS. En conclusión, los resultados de esta tesis indican que existe una regulación ambiental de las modificaciones del lípido A de H. pylori, pero estas modificaciones producidas por la alteración del pH del medio de cultivo no afectarían las propiedades proinflamatorias de la molécula en células gástricas

Helicobacter pylori is a Gram-negative bacterium belonging to the epsilonproteobacteria class, and one of the few microorganisms able of colonizing the gastric human epithelium, being the only pathogen associated with the development of peptic ulcers and gastric carcinomas. It is estimated that its prevalence is about 50% worldwide, due in part to the development of multiple strategies and mechanisms that allow it to evade the host immune system. One of the main H. pylori virulence factors is its lipopolysaccharide (LPS), the major component of the outer leaflet of its outer membrane. The portion of this molecule that anchors it to the membrane is called lipid A, and is characterized for being the toxic component of LPS. This glycolipid may exhibit covalent modifications that alter its bioactivity. In the case of H. pylori, the lipid A is distinguished for being a highly modified structure that confers it a low immunoreactivity when compared to the same molecule from enterobacteria. Until recently, it was considered that the lipid A of H. pylori exhibited several modifications of constitutive character, however recent publications have demonstrated that there are some environmental cues able of modify the distribution of lipid A species. Among the most important environmental signals recognized by this pathogen are: the acidity, the presence of divalent metals and some host metabolites. These signals can be associated to the regulation of the virulence and the adaptation to environmental conditions. In this thesis the effect of acidity and iron availability as determinant environmental cues in the distribution of lipid A species of H. pylori was analyzed, because they are signals highly relevant to the regulation of other virulence factors, such as toxins production and expression of several genes involved in the biosynthetic route of the LPS in this bacterium. This work included an in-deep analysis of transcriptomic arrays that showed the relationship between the acidity sensor protein (ArsS) and the expression of genes encoding lipid A modifying enzymes. Furthermore, a prediction of Furbinding sites was made to support the proposal that iron is an environmental cue involved in the modification of lipid A. The influence of this environmental factors was also evaluated experimentally, using lipid A mass spectrometry and analysis of electrophoretic profiles of LPS. The mass spectra indicated that the iron availability causes minor changes in the distribution of lipid A distribution. In contrast, the spectra of the samples obtained from bacteria grown at different pH show more drastic changes in the proportion of the species, being the most significant a change in the majority species detected at pH 5 and 7. This phenomenon has not been described in H. pylori and could indicate a possible change in the proinflammatory activity of the LPS of bacteria grown under these pHs. On the other hand, the analysis of the electrophoretic profile of these samples indicated that he LPS obtained from H. pylori grown at pH 7 exhibits differences in the intensity of the intermedium mobility bands compared to the LPS obtained from bacteria grown at pH 5. Finally, the effect of the LPS extracted from H. pylori grown at different pH does not show significant changes in the expression of IL-8 in AGS cells. In conclusion, the results of this thesis indicate that there is an environmental regulation of the lipid A modifications of H. pylori, but these modifications produced by the alteration of the pH on the culture medium does not affect the proinflammatory properties of the molecule in gastric cells